权利要求
无
说明书
技术领域
[0001]本发明涉及材料
分析检测技术领域，具体涉及一种功能性含氟纳米磁珠的制备方法及应用。
背景技术
[0002]随着蛋白质组学的研究与质谱仪的准确性与灵敏度的提高，目前基于质谱方法检测PTMs已经成为常用手段之一。然而如何实现快速、大量的检测成了限制质谱在蛋白组学中应用的关键。常见的方法大多是利用生物素标记法，通过亲和分离以及纯化进行质谱检测。然而在分离与纯化的过程中，未反应的生物素标签难以从捕获树脂中洗脱，且生物素标签在质谱测试过程中会发生解离。导致在数据分析过程中观察到大量的被解离的分子碎片，导致在鉴定低丰度物质中产生的误差较大。为了解决这一问题的困扰，近年来提出了利用氟亲和标签(Fluorousaffinitytag, FAT) 来代替生物素作为标记物应用于蛋白质组学方法的开发中。我们曾利用 TFIA作为标签实现对拟南芥体内的S-亚硝基化修饰的肽段进行定量检测(参照文献：1 Guochen Qin, Menghuan Qu, Bei Jia, Wei Wang, ZhoujunLuo, Chun-Peng Song, W. Andy Tao, Pengcheng Wang. FAT-switch-basedquantitative S-nitrosoproteomics reveals a key role of GSNOR1 in regulatingER functions. Nat. Commun., 2023, 14, 3268.)。在实验过程中选择C18富集柱对含有TFIA标签的肽段进行标记，但由于C18富集柱无法实现特异性富集，因此导致富集效率稳定性较差。
[0003]为了提高对含氟标签的特异性富集，也为了能够更好的实现高通量、自动化检测。我们尝试利用磁珠这一广泛应用于生物医学领域的一种新型功能性材料实现提高富集效率、自动化检测的目标。我们利用氟与氟之间的键合能力远强于氟与氢之间的键合能力的特点，尝试将含氟
硅烷与功能性磁珠结合，来构建能够批量的、特异性的富集含有氟标签的肽段的方法。
发明内容
[0004]本发明的目的是针对以上问题提供一种功能性含氟纳米磁珠的制备方法及应用，分别用于制备含氟纳米磁珠、构建富集含有氟标签的肽段的方法。
[0005]为达到上述目的，本发明公开了一种功能性含氟纳米磁珠的制备方法及应用，该功能性含氟纳米磁珠的制备方法包括如下步骤：步骤A100、利用二氧化硅包裹四氧化三铁与含氟硅烷的偶联反应得到含有功能性含氟纳米磁珠的混合物;步骤A200、对含有功能性含氟纳米磁珠的混合物进行清洗，得到功能性含氟纳米磁珠。
[0006]进一步的，所述二氧化硅包裹四氧化三铁与含氟硅烷的偶联反应的结构式表示如下：
[0007]进一步的，所述步骤A100包括：步骤A101、将二氧化硅包裹四氧化三铁溶于乙醇溶液中;步骤A102、加入含氟硅烷和氨水，二氧化硅包裹四氧化三铁与含氟硅烷发生偶联反应，得到含有功能性含氟纳米磁珠的混合物。
[0008]进一步的，所述步骤A102中加入含氟硅烷和氨水后，观察到分层现象后，在50oC下反应至上方悬浊液澄清，下层氟相逐渐浑浊，得到含有功能性含氟纳米磁珠的混合物。
[0009]进一步的，所述步骤A200包括：步骤A201、含有功能性含氟纳米磁珠的混合物在磁力作用下除掉上层乙醇相及下层氟相溶液;步骤A202、加入全氟辛烷洗涤，磁力作用下去除溶液;步骤A203、加水溶液洗涤，磁力作用下去除溶液;步骤A204、加入甲醇水混合溶液洗涤，磁力作用下去除溶液;步骤A205、加入甲醇溶液洗涤，磁力作用下去除溶液;步骤A206、吹干得到功能性含氟纳米磁珠。
[0010]本发明还公开了一种功能性含氟纳米磁珠的应用方式，该功能性含氟纳米磁珠由二氧化硅包裹四氧化三铁与含氟硅烷的偶联反应得到，该功能性含氟纳米磁珠用于富集含有氟标签的肽段。
[0011]优选的，所述功能性含氟纳米磁珠通过以上所述的方法制备得到。
[0012]进一步的，功能性含氟纳米磁珠的应用包括如下步骤：步骤B100、用氟标签标记蛋白质;步骤B200、用FASP方法酶解蛋白质;步骤B300、用功能性含氟纳米磁珠富集氟标签标记肽段，洗脱并收集富集后的肽段;步骤B400、利用液相色谱串联质谱对收集到的肽段进行检测。
[0013]进一步的，所述步骤B100包括：将待测蛋白质置于离心管中加入氟标签化合物对目标肽段进行标记，反应结束后采用FASP方法进行酶解;
进一步的，所述步骤B200包括：碳酸氢铵溶液置换洗涤，重复多次;加入酶进行酶解反应;加入酸溶液终止酶解反应，离心后上层清液通过真空浓缩处理。
[0014]进一步的，所述步骤B300包括：将功能性含氟纳米磁珠与肽段溶液混合;孵育后在磁力作用下分离功能性含氟纳米磁珠与溶液;用缓冲溶液和有机溶剂的混合溶液洗涤功能性含氟纳米磁珠;用有机溶剂洗脱功能性含氟纳米磁珠上的肽段。
[0015]综上所述，本发明的有益效果在于：本发明所制备的功能性含氟纳米磁珠实现了对肽段的高效、特异性富集，解决了传统生物素标记法中未反应标签难以洗脱及标签解离导致质谱分析误差的问题，通过应用该功能性含氟纳米磁珠实现了高通量、自动化检测，为蛋白质组学研究提供了一种重要手段。
附图说明
[0016]图1是本发明中功能性含氟纳米磁珠的粒径图。
具体实施方式
[0017]以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下列实施例的限定。
[0018]本发明公开了功能性含氟纳米磁珠制备方法的一种实施例，具体步骤如下。
[0019]步骤1：功能性含氟纳米磁珠 1的合成制备
将5 mg二氧化硅包裹四氧化三铁 (Fe3O4@SiO2) 溶于1 mL乙醇溶液中。依次加入1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷(PFTS)与1.5 mL氨水后观察到明显的分层现象。上层为二氧化硅包裹四氧化三铁(Fe3O4@SiO2) 的悬浊液，下层为1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷 (PFTS) 溶液。在50oC条件下反应至上方悬浊液澄清，下层氟相逐渐浑浊，说明已经生成了功能性含氟纳米磁珠1 (Fe3O4@SiO2@PFTS)。
[0020]步骤2：功能性含氟纳米磁珠的清洗
将离心管放置在磁力架上静置5 min后用移液枪吸取上层乙醇相及下层氟相溶液。
[0021]撤去磁力架后，加入200 μL全氟辛烷洗涤，5 min后重新放置在磁力架上静置5min后用移液枪吸去溶液，丢弃掉该溶液，重复该操作2-3次。
[0022]加入200 μL水溶液洗涤，5 min后重新放置在磁力架上静置5 min后用移液枪吸去溶液，丢弃掉该溶液，重复该操作2-3次。
[0023]加入200 μL甲醇水混合溶液洗涤，5 min后重新放置在磁力架上静置5 min后用移液枪吸去溶液，丢弃掉该溶液，重复该操作2-3次。
[0024]加入200μL甲醇溶液洗涤，5 min后重新放置在磁力架上静置5 min后用移液枪吸去溶液，丢弃掉该溶液，重复该操作2-3次。用N2吹干，备用。
[0025]由此制备出适用于富集氟标签标记肽段的功能性含氟纳米磁珠，图1为功能性含氟纳米磁珠的粒径图。
[0026]该方法适用于多种含氟硅烷与不同尺寸的功能性纳米磁珠的制备，所制备出的功能性含氟纳米磁珠可以用于富集含有氟标签的肽段。
[0027]本发明还公开了功能性含氟纳米磁珠的用于富集氟标签的肽段的两种实施例。
实施例1
[0028]5 mg 二氧化硅包裹四氧化三铁(Fe3O4@SiO2)与50mg 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅 (PFTS) 遵循前述氟纳米磁珠制备方法得到功能性含氟纳米磁珠1 (Fe3O4@SiO2@PFTS)。
[0029]用氟标签N-[(3-全氟己基)-丙基]-碘乙酰胺 (TFIA) 标记牛血清蛋白 (BSA)。200 μg BSA (1mg/mL) 置于10KDa的滤膜中，溶于10 mM 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP) 中，在37oC条件下反应1h;
加入700 μg TFIA，室温下避光处理2h后离心，除去未反应的TFIA;
加入200 μL碳酸氢铵溶液 (50 mM) 置换洗涤，重复3次。
[0030]按照1:50比例加入胰蛋白酶 (500 μL体系)，37℃摇床中孵育过夜 (13-16h);
加入10%甲酸水溶液终止酶解反应，离心后上层清液通过真空浓缩后标记为样品-TFIA备用;
含氟纳米磁珠1富集氟标签标记肽段:取5 mg含氟纳米磁珠1 与样品-TFIA分别溶于200 μL 50% 25 mM碳酸氢铵50%甲醇混合溶液。混合均匀后，在24oC,600rpm条件下,孵育10min后取出放置磁力架上静置5 min后，丢弃溶液;
200 μL 25 mM碳酸氢铵动作轻柔的将磁珠充分打散清洗，静置在磁力架5 min后，丢弃溶液;
200 μL 60% 25 mM碳酸氢铵40%甲醇混合溶液洗涤，将磁珠充分打散清洗，静置在磁力架5min后，丢弃溶液;
40 % 25 mM碳酸氢铵60%甲醇混合溶液洗涤，将磁珠充分打散清洗，静置在磁力架5 min后，丢弃溶液;
用200 μL甲醇溶液通过离心的方法洗脱后收集溶液，后冻干备用。
[0031]冻干后的样品溶于7 μL溶样液(5%乙腈0.2%甲酸水溶液) 后利用液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 测试。分析数据后得到该方法富集到含有氟标签标记的肽段量为82，总肽段量为137，富集效率为60%。
实施例2
[0032]5mg 二氧化硅包裹四氧化三铁(Fe3O4@SiO2)与50 mg 1H,1H,2H,2H-全氟己基三乙氧基硅烷(TFPS)遵循前述氟纳米磁珠制备方法得到功能性含氟纳米磁珠2 (Fe3O4@SiO2@TFPS)。
[0033]用氟标签2-碘-N-(4,4,5,5,6,6,7,7,7-九氟庚基)乙酰胺 (NFIA) 标记牛血清蛋白BSA。200 μg BSA (1mg/mL) 置于10KDa的滤膜中，溶于10 mM 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐TCEP 中，在37oC条件下反应1h;
加入700 μg NFIA，室温下避光处理2 h后离心，除去未反应的NFIA;
加入200 μL碳酸氢铵溶液 (50 mM) 置换洗涤，重复3次。
[0034]按照1:50比例加入胰蛋白酶 (500 μL体系)，37oC摇床中孵育过夜 (13-16h);
加入10%甲酸水溶液终止酶解反应，离心后上层清液通过真空浓缩后标记为样品-NFIA备用;
含氟纳米磁珠2富集氟标签标记肽段。
[0035]取5 mg含氟纳米磁珠2与样品-NFIA分别溶于200 μL 50% 25 mM碳酸氢铵50%甲醇混合溶液，混合均匀后，在24oC,600rpm条件下,孵育10 min后取出放置磁力架上静置5 min后，丢弃溶液;
200μL 25 mM碳酸氢铵动作轻柔的将磁珠充分打散清洗，静置在磁力架5min后，丢弃溶液;
200μL 60% 25 mM碳酸氢铵40%甲醇混合溶液洗涤，将磁珠充分打散清洗，静置在磁力架5 min后，丢弃溶液;
40% 25 mM碳酸氢铵60%甲醇混合溶液洗涤，将磁珠充分打散清洗，静置在磁力架5min后，丢弃溶液;
用200 μL甲醇溶液通过离心的方法洗脱后收集溶液，后冻干备用。
[0036]冻干后的样品溶于7 μL溶样液(5%乙腈0.2%甲酸水溶液) 后利用液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 测试。分析数据后得到该方法富集到含有氟标签标记的肽段量为97，总肽段量为150，富集效率为65%。
[0037]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。
说明书附图(1)
声明：
“功能性含氟纳米磁珠的制备方法及应用” 该技术专利(论文)所有权利归属于技术(论文)所有人。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系该技术所有人。
我是此专利(论文)的发明人(作者)
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编辑：中冶有色技术网
来源：北京大学现代农业研究院
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2024年12月27日 ~ 29日 
