权利要求
1.一种嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2024年12月4号，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.32892。
2.权利要求1所述的嗜吡啶红球菌Rho48在处理含氮杂环化合物废水中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括将嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4组合使用，赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2024年12月4号，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.32891。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
将嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4分别制备成菌悬液;
然后将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液加入废水中。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液加入废水中包括：
所述嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液先混合后再加入废水中;或
所述嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液分别加入废水中。
6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于，所述含氮杂环化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
7.权利要求1所述的嗜吡啶红球菌Rho48在制备微生物菌剂中的应用。
8.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括：嗜吡啶红球菌Rho48;或所述微生物菌剂包括：嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4。
9.一种处理含氮杂环化合物废水的方法，其特征在于，所述方法包括：向废水中添加嗜吡啶红球菌Rho48;或向废水中添加嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4。
说明书
技术领域
[0001]本发明属于废水处理技术领域，具体涉及降解含氮杂环化合物的微生物及其在废水处理中的应用。
背景技术
[0002]含氮杂环化合物是指分子中含有氮原子且氮原子作为杂原子参与形成环状结构的有机化合物，主要包括五元含氮杂环化合物吡咯、咪唑、吡唑和噻唑，六元含氮杂环化合物吡啶、嘧啶和吡嗪，苯并杂环化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和苯并咪唑，杂环并杂环化合物嘌呤和蝶啶等。其中，吡啶、吲哚、喹啉、苯并噻唑等是普遍存在焦化废水等工业废水中的难降解有机污染物，这些含氮杂环化合物因其致畸、致癌、致突变的特性，对环境和人体健康构成了严重威胁。
[0003]常见含氮杂环化合物的处理工艺有：催化湿式氧化法、生物降解法和物理化学法。其中，生物降解法利用不同类型微生物的新陈代谢作用将含氮杂环化合物降解转化成无机物，从而实现污染物的去除。生物降解法具有经济高效、无二次污染且作用条件相对温和的特点，是目前含氮杂环化合物去除和转化的有效方式。近年来，一些具有显著降解含氮杂环化合物能力的功能菌株被分离和培养，如红球菌、伯克霍尔德氏菌、假单孢菌、芽孢杆菌和副球菌等，这些降解菌株被认为是强化去除含氮杂环化合物的潜在资源。
[0004]然而，在利用功能菌株处理含氮杂环化合物时发现，功能菌株对含氮杂环化合物具有特异性，单一降解菌株无法同时降解多种类型含氮杂环化合物，或者其能够降解的含氮杂环化合物种类较少。例如，研究发现高效降解菌Bacillussp. L1在处理吲哚、喹啉、吡啶和3-甲基吲哚的复合污染时，其对吡啶和3-甲基吲哚无明显降解作用。这可能是因为降解菌株拥有有限的代谢途径，仅能够针对特定的一种或少数几种含氮杂环化合物进行降解。
[0005]在实际工业生产过程中，废水中的含氮杂环化合物往往并非是孤立的一种。因此，提供更多降解含氮杂环化合物的微生物，以适应不同的废水处理显得尤为重要。
发明内容
[0006]1. 要解决的问题
一方面，本发明针对降解含氮杂环化合物的微生物具有底物(含氮杂环化合物)特异性，从而导致含氮杂环化合物废水处理受限的技术问题，提供一株新的降解含氮杂环化合物的微生物嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，该微生物具有广谱性，能够降解至少包括喹啉、苯并噻唑或吡啶在内的三种含氮杂环化合物。
[0007]另一方面，本发明还针对嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48降解吲哚效果不足的技术问题，提供另一株降解含氮杂环化合物的微生物赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，将两种微生物组合使用，形成复合菌群以提供更多的代谢途径，提高了吲哚的降解效果。
[0008]2. 技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供一种嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为2024年12月4号，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.32892;该嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48筛选自无锡市政
污水处理厂膜生物反应器的活性污泥，具有广谱性，能够降解吲哚、喹啉、苯并噻唑或吡啶在内的多种含氮杂环化合物，其中对喹啉、苯并噻唑和吡啶具有非常高的降解效率。
[0009]本发明还提供了上述嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48在处理含氮杂环化合物废水中的应用，嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48可以降解废水中的含氮杂环化合物。
[0010]进一步地，上述应用中，含氮杂环化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
[0011]进一步地，上述应用中，含氮杂环化合物包括喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
[0012]进一步地，上述应用中，含氮杂环化合物包括喹啉或苯并噻唑或吡啶。
[0013]进一步地，上述应用中，还包括将嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4组合使用，赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为2024年12月4号，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.32891;嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4可以形成复合菌群，能够进一步提高废水中的含氮杂环化合物的降解效果。
[0014]进一步地，上述应用中，组合使用包括：将嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4分别制备成菌悬液;然后将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液混合后加入废水中或者将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液分别加入废水中;嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液分别加入废水中，本发明对其加入的先后顺序不做限制，可以是先加入嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液，也可以是先加入赤红球菌Rho4菌悬液，也可以是两种同时加入。
[0015]进一步地，上述应用中，含氮杂环化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
[0016]进一步地，上述应用中，含氮杂环化合物包括吲哚;与单个微生物降解相比，组合使用后能够显著提高吲哚的降解和矿化效果，推测是因为嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4形成复合菌群，发挥协同作用，提供了更多的代谢途径。
[0017]进一步地，上述应用中，废水包括焦化废水、印染废水、制药废水和/或橡胶废水等工业废水。
[0018]本发明还提供一种赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为2024年12月4号，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.32891;该赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4筛选自无锡市政污水处理厂膜生物反应器的活性污泥，该赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4能够在一定程度上降解含氮杂环化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶;将其与嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48组合使用，能够进一步提高对含氮杂环化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶降解和矿化效果，尤其是含氮杂环化合物吲哚，能够发挥嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4的协同作用，与单个微生物降解相比，显著提高吲哚的降解和矿化效果。
[0019]本发明还提供了上述赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4在处理含氮杂环化合物废水中的应用，该应用包括将赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4和嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48组合使用，降解废水中的含氮杂环化合物。
[0020]进一步地，上述应用中，组合使用包括：将嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4分别制备成菌悬液;然后将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液混合后加入废水中或者将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液分别加入废水中。
[0021]进一步地，上述应用中，含氮杂环化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
[0022]进一步地，上述应用中，含氮杂环化合物包括吲哚。
[0023]进一步地，上述应用中，废水包括焦化废水、印染废水、制药废水和/或橡胶废水等工业废水。
[0024]本发明还提供了上述嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4在制备微生物菌剂中的应用。
[0025]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包括：嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48。
[0026]本发明还提供了上述一种微生物菌剂在处理含氮杂环化合物废水中的应用。
[0027]进一步地，上述应用包括：将嗜吡啶红球菌Rho48制备成菌悬液;然后加入废水中，嗜吡啶红球菌Rho48可以降解废水中的含氮杂环化合物。
[0028]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包括：嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4分离包装。
[0029]本发明还提供了上述一种微生物菌剂在处理含氮杂环化合物废水中的应用。
[0030]进一步地，上述应用包括：将嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4分别制备成菌悬液;然后将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液混合后加入废水中或者将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液分别加入废水中，嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4可以形成复合菌群，能够进一步提高废水中的含氮杂环化合物的降解效果。
[0031]本发明还提供了一种处理含氮杂环化合物废水的方法，该方法包括：向废水中添加上述嗜吡啶红球菌Rho48。
[0032]进一步地，上述方法中，将嗜吡啶红球菌Rho48制备成菌悬液;然后加入废水中，嗜吡啶红球菌Rho48可以降解废水中的含氮杂环化合物。
[0033]进一步地，上述方法中，含氮杂环化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
[0034]进一步地，上述方法中，含氮杂环化合物包括喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
[0035]进一步地，上述方法中，废水包括焦化废水、印染废水、制药废水和/或橡胶废水等工业废水。
[0036]本发明还提供了一种处理含氮杂环化合物废水的方法，该方法包括：向废水中添加上述嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4。
[0037]进一步地，上述应用包括：将嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4分别制备成菌悬液;然后将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液混合后加入废水中或者将嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液分别加入废水中，嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4可以形成复合菌群，能够进一步提高废水中的含氮杂环化合物的降解效果。
[0038]进一步地，上述方法中，含氮杂环化合物包括吲哚、喹啉、苯并噻唑、吡啶中的任意一种或多种。
[0039]进一步地，上述方法中，含氮杂环化合物包括吲哚。
[0040]进一步地，上述方法中，废水包括焦化废水、印染废水、制药废水和/或橡胶废水等工业废水。
[0041]进一步地，上述应用或方法中，嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液的制备包括：将嗜吡啶红球菌Rho48接种于LB液体培养基中，35~40℃，150~250 rpm培养24~48 h。
[0042]进一步地，上述应用或方法中，赤红球菌Rho4菌悬液的制备包括：将赤红球菌Rho4接种于LB液体培养基中，35~40℃，150~250 rpm培养24~48 h。
[0043]进一步地，上述嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液或赤红球菌Rho4菌悬液的制备，培养条件为37℃，180 rpm培养36 h。
[0044]进一步地，上述应用或方法中，嗜吡啶红球菌Rho48或赤红球菌Rho4的接种生物量为：接种生物量为OD600=0.05~0.1。
[0045]进一步地，上述应用或方法中，嗜吡啶红球菌Rho48或赤红球菌Rho4的接种生物量比为1:1。
[0046]进一步地，上述应用或方法中，处理含氮杂环化合物废水的温度为35~40℃;pH为6.5~7.5;转速为150~250 rpm;处理时间为0~72 h。
[0047]进一步地，上述应用或方法中，处理含氮杂环化合物废水的温度为37℃;pH为6.5~7.5;转速为180 rpm;处理时间为24~72 h。
[0048]进一步地，上述应用或方法中，处理时间为48~72 h。
[0049]3. 有益效果
本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本发明提供的降解含氮杂环化合物的微生物及其在废水处理中的应用，该降解含氮杂环化合物的微生物为筛选自无锡市政污水处理厂膜生物反应器的活性污泥的嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48，具有广谱性，能够降解和矿化吲哚、喹啉、苯并噻唑或吡啶在内的多种含氮杂环化合物，尤其是对喹啉、苯并噻唑和吡啶具有非常高的降解和矿化效率，降解效率接近100%。
[0050](2)本发明提供的降解含氮杂环化合物的微生物及其在废水处理中的应用，该降解含氮杂环化合物的微生物为筛选自无锡市政污水处理厂膜生物反应器的活性污泥的赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4，该赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4能够在一定程度上降解和矿化含氮杂环化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶。此外，将其与嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48组合使用，两者可以形成复合菌群，能够进一步提高对含氮杂环化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶降解和矿化效果，降解率均高达98%;尤其是含氮杂环化合物吲哚，能够发挥嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4的协同作用，与单个微生物降解和矿化相比，显著提高吲哚的降解和矿化效果。
[0051](3)本发明提供的降解含氮杂环化合物的微生物及其在废水处理中的应用，无论是嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48单独使用，还是嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48与赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4组合使用，均能够降解和矿化至少包括喹啉、苯并噻唑或吡啶在内的三种含氮杂环化合物，使得处理含氮杂环化合物废水，尤其是同时含有多种含氮杂环化合物的复合污染废水时，具有更多选择性。
附图说明
[0052]图1是本发明提供的单菌株嗜吡啶红球菌Rho48和单菌株赤红球菌Rho4对单一含氮杂环化合物的处理结果。
[0053]图2是本发明提供的嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对单一含氮杂环化合物的降解结果。
[0054]图3是本发明提供的嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对单一含氮杂环化合物的矿化结果。
[0055]图4是本发明提供的嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对含氮杂环化合物复合污染(吲哚10 mg/L+喹啉10 mg/L+吡啶10 mg/L)的处理结果。
[0056]图5是本发明提供的嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对含氮杂环化合物复合污染(吲哚25 mg/L +喹啉25 mg/L)的处理结果。
具体实施方式
[0057]下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0058]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同;本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0059]实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0060]如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
[0061]如本文所使用，术语“……任意一种或多种”旨在与“……中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的任意一种或多种”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。
[0062]浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
[0063]实施例1
本实施例提供嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4的分离与鉴定。
[0064](1)嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4的分离
用以富集降解含氮杂环化合物菌株的基质取自无锡市政污水处理厂膜生物反应器的活性污泥，通过梯度富集策略(增加含氮杂环化合物苯并噻唑浓度的同时减少葡萄糖浓度)获得富集菌液。
[0065]所获富集菌液，使用无菌超纯水稀释至10-4~10-7，吸取100 μL稀释菌液均匀涂布在以葡萄糖为唯一碳源的无机盐固体培养基上，于37℃恒温培养箱中静置培养5~7 d，挑取不同形态的单菌落在固体培养基上进行多次划线培养，以获得纯化菌株。其中：无机盐培养基的组成为：葡萄糖281 mg/L，NH4Cl 57.3 mg/L，KH2PO413.2 mg/L，MgSO4•7H2O 15 mg/L，CaCl2•2H2O 16.5 mg/L，MnCl2•4H2O 100 μg/L，FeSO4•7H2O 80 μg/L，ZnSO4•7H2O 40 μg/L，CuSO4•5H2O 20 μg/L，Na2MoO4•2H2O 20 μg/L，CoCl2•6H2O 10 μg/L。
[0066]纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，于恒温摇床37℃，180 rpm进行扩大培养，备用。其中：LB培养基的组成为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。
[0067](2)嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4的鉴定
对上述纯化后的菌株培养液用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，其中引物序列为：
27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.1);
1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTAYGACTT-3’(SEQ ID NO.2);
PCR反应体系为：12.5 μL 2 ×EasyTaq®PCR SuperMix(全式金，中国)、10.5 μL无菌无酶水、正向引物0.5 μL(10 μM)、反向引物0.5 μL(10 μM)和1 μL菌液;
PCR程序设定为：95℃预变性8 min;95℃变性20 s，55℃退火25 s，72℃延伸70 s，共循环32次;72℃延伸5 min。
[0068]将上述PCR产物使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(Takara，日本)进行纯化，经16SrDNA测序，所得核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，在NCBI-nr数据库中对上述序列进行BLAST同源性比对。
[0069]结果表明，分离获得的菌株分别为嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)和赤红球菌(Rhodococcus ruber)，本发明中分别命名为嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)Rho48和赤红球菌(Rhodococcus ruber)Rho4。上述嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为2024年12月4号，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为CGMCCNo.32892和CGMCC No.32891。
[0070]序列SEQ ID NO.3(经鉴定为嗜吡啶红球菌)：
CGGGGGGGGGGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCGGGATGCATGTTCTGGGGTGGAAAGTTTTTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATCCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTCGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCCAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGTACCGGACGACTGCAGAGATGTGGTTTCCCTTGTGGCCGGTAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCTAACTCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGAGCCCCCCCC。
[0071]序列SEQ ID NO.4(经鉴定为赤红球菌)：
TTTGGGGGGGGGGCTTACCATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTACCGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGGTACAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGACCGCCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTCGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCCGGCG。
[0072]实施例2
本实施例提供单菌株嗜吡啶红球菌Rho48对单一含氮杂环化合物的降解实验，包括以下步骤：
(1)制备嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液
将嗜吡啶红球菌Rho48接种于高温高压灭菌后的LB液体培养基中，于恒温摇床37℃，180 rpm进行扩大培养;36 h后菌株培养至对数期，取出菌液8000×g离心2 min，弃上清液，使用PBS(磷酸盐缓冲溶液)重悬沉淀菌体，上述操作重复3次;最后，使用无机盐培养基(同实施例1)重悬沉淀菌体，获得嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液备用。
[0073](2)单一含氮杂环化合物的降解
在无机盐培养基中(同实施例1)先加入10 mg/L的单一含氮杂环化合物，分别为吲哚、喹啉、苯并噻唑和吡啶以模拟含氮杂环化合物废水，再接种上述制备好的嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液，保证接种后生物量在OD600=0.05~0.1之间，最终建立100 mL的降解体系，调节体系pH在6.5~7.5之间。
[0074]降解条件为37℃，于磁力搅拌器上以转速180 rpm形成好氧条件，处理时间为48h。
[0075]每个实验组均设置3个重复，于0 h和48 h取样检测含氮杂环化合物浓度和总有机碳浓度(TOC)。
[0076]上述含氮杂环化合物浓度利用高效液相色谱(HPLC, 1260 Infinity Ⅱ,Agilent Technologies, USA)进行测定，检测器类型为紫外光源(DAD-3000, AgilentTechnologies, USA)，色谱柱为C18柱(4.6 × 250 mm, 5 μm, Agilent Technologies,USA)，检测条件见下表1：
表1
[0077]TOC浓度依照《水质 总有机碳的测定 燃烧氧化-非分散红外吸收法》(HJ 501-2009)进行测定。
[0078](3)结果分析
实验结果如图1所示，嗜吡啶红球菌Rho48对喹啉、苯并噻唑和吡啶的降解率高达98%左右，对于苯并噻唑和吡啶的矿化率在50%以上，具有一定的广谱高效处理性能;但对吲哚的处理性能整体较弱，其降解率和矿化率均低于20%以下。
[0079]实施例3
本实施例提供单菌株赤红球菌Rho4对单一含氮杂环化合物的降解实验，包括以下步骤：
(1)制备赤红球菌Rho4菌悬液
将赤红球菌Rho4接种于高温高压灭菌后的LB液体培养基中，于恒温摇床37℃，180rpm进行扩大培养;36 h后菌株培养至对数期，取出菌液8000×g离心2 min，弃上清液，使用PBS(磷酸盐缓冲溶液)重悬沉淀菌体，上述操作重复3次;最后，使用无机盐培养基(同实施例1)重悬沉淀菌体，获得赤红球菌Rho4菌悬液备用。
[0080](2)单一含氮杂环化合物的降解
在无机盐培养基中(同实施例1)先加入10 mg/L的单一含氮杂环化合物，分别为吲哚、喹啉、苯并噻唑和吡啶以模拟含氮杂环化合物废水，再接种上述制备好的赤红球菌Rho4菌悬液，保证接种后生物量在OD600=0.05~0.1之间，最终建立100 mL的降解体系，并调节体系pH在6.5~7.5之间。
[0081]降解条件为37℃，于磁力搅拌器上以转速180 rpm形成好氧条件，处理时间为48h。
[0082]每个实验组均设置3个重复，于0 h和48 h取样检测含氮杂环化合物浓度和总有机碳浓度(TOC)。
[0083]含氮杂环化合物和TOC浓度的检测方法同实施例2。
[0084](3)结果分析
实验结果如图1所示，赤红球菌Rho4对上述四种含氮杂环化合物的降解性能和矿化能力均较低，较突出的吡啶组，降解率仍低于40%以下，矿化率也低于20%。
[0085]实施例4
本实施例提供嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对单一含氮杂环化合物的降解实验，包括以下步骤：
制备单菌株菌悬液嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液制备同实施例2;赤红球菌Rho4菌悬液制备同实施例3。
[0086](2)单一含氮杂环化合物的降解
区别实施例2或3中接种单菌株嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液或赤红球菌Rho4菌悬液，本实施例在各模拟含氮杂环化合物废水中(同实施例2或3)分别接种嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液，嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4等比例接种，且保证接种生物量均在OD600=0.05~0.1之间，体系中其它组成、降解条件及含氮杂环化合物和TOC浓度的检测均同实施例2或实施例3。
[0087](3)结果分析
嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对单一含氮杂环化合物的降解结果如图2所示，在48 h的降解时间内，对单一含氮杂环化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和吡啶的降解率均超过98%，相较于实施例2和实施例3中单菌株降解效果，组合使用进一步提高对含氮杂环化合物吲哚、喹啉、苯并噻唑和/或吡啶降解效果，具有更广谱高效的处理能力，能够满足更多种含氮杂环化合物接近100%去除的需求。
[0088]嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对单一含氮杂环化合物的矿化结果如图3所示，对于喹啉矿化率在50%左右，对于吲哚、苯并噻唑和吡啶的矿化率最高可达84%左右，相较于单菌株的处理，矿化效果也均有显著的提高。
[0089]上述结果表明，嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用能够有效实现对含氮杂环化合物母体及降解过程中产生的中间体的共同转化，这一结果可能源于嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4在废水中形成复合菌群，发挥两者的协同作用。尤为突出的是，相较于单菌株Rho48或Rho4对于吲哚的低降解低矿化，组合使用其降解率和矿化率均得到了明显的提升。
[0090]实施例5
本实施例提供嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对含氮杂环化合物复合污染废水的处理。
[0091]在本实施例中，为评估该复合菌群对废水中含氮杂环化合物复合污染的处理能力，本实施例模拟焦化废水中含氮杂环化合物复合污染的情况。
[0092]在本实施例中，模拟焦化废水的制备包括：在无机盐培养基中(同实施例1)先加入各含氮杂环化合物，最终模拟焦化废水为：
A：10 mg/L吲哚+10 mg/L喹啉+10 mg/L吡啶;
B：25 mg/L吲哚+25 mg/L喹啉。
[0093]嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对含氮杂环化合物复合污染废水的处理包括以下步骤：
制备单菌株菌悬液嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液制备同实施例2;赤红球菌Rho4菌悬液制备同实施例3。
[0094]含氮杂环化合物复合污染的降解参考实施例4，在模拟焦化废水中分别接种嗜吡啶红球菌Rho48菌悬液和赤红球菌Rho4菌悬液，嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4等比例接种，且保证接种生物量均在OD600=0.05~0.1之间，体系中其它组成、降解条件及含氮杂环化合物和TOC浓度的检测均同实施例2或实施例3，处理时间延长至72 h;于0 h、24 h、48 h及72 h取样检测含氮杂环化合物和TOC浓度。
[0095]结果分析嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4组合使用对模拟焦化废水A中三种含氮杂环化合物复合污染的处理结果如图4所示，48 h内实现吲哚和喹啉的完全降解;72 h内实现吡啶的完全降解，72 h内整体矿化效果接近50%左右;对模拟焦化废水B中两种含氮杂环化合物复合污染的处理结果如图5所示，在吲哚和喹啉浓度提升至25 mg/L后，72 h内该复合菌群依然能够实现吲哚和喹啉的接近100%降解。
[0096]上述实验结果表明本发明中的嗜吡啶红球菌Rho48和赤红球菌Rho4具有良好的处理实际废水中含氮杂环化合物复合污染的应用潜能，可以单独使用嗜吡啶红球菌Rho48，或者将其与赤红球菌Rho4组合使用，能够对多种含氮杂环化合物的复合污染进行高效降解和矿化。
说明书附图(5)
声明：
“降解含氮杂环化合物的微生物及其在废水处理中的应用” 该技术专利(论文)所有权利归属于技术(论文)所有人。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系该技术所有人。
我是此专利(论文)的发明人(作者)
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编辑：中冶有色技术网
来源：南京大学
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2025年03月20日 ~ 22日 
