Ti-Zr-Cu合金的抗菌性能和体外生物相容性

用种植体替代缺失牙已经成为一种常规的治疗选择，其适应症不断扩大 纯钛(Ti)和钛合金是应用最为广泛的种植体材料 单颗牙或前牙的缺失，往往使牙间隙和牙根间隙不足或颌骨改建后其宽度很窄[1] 对此除了进行常规的附加骨增量[2]，还可选用窄直径种植体 但是，与常规直径的种植体相比，相同强度水平的窄直径种植体的承载能力会下降，应力水平的提高使疲劳折裂的风险大大增加[3] 因此，不推荐用窄直径种植体修复单独的尖牙、前磨牙和磨牙 为了提高种植体的机械强度，新近发展出的高强度钛锆(Ti-Zr)合金的窄直径种植体已经临床应用 例如，Straumann公司推出的Roxolid钛锆合金种植体，其机械性能较高，体外细胞实验、动物实验和临床实验结果表明其耐蚀性能、骨亲和力和生物相容性等都不低于纯钛[3-5]，其硬度、弹性模量，拉伸和抗曲强度甚至优于纯钛[6]

一些病例表明，种植体失败最常见的原因是其周围黏膜炎和种植体周围炎[7] 这些炎症，与种植体表面生成的细菌生物膜使种植体感染相关 钛合金是生物惰性材料，没有抗菌性能，因此赋予其抗菌性能对于开发窄直径种植体意义重大 目前许多研究都集中在减少钛种植体表面上的细菌粘附，包括表面处理[8]、光化学反应 [9]、银合金化[10]以及铜合金化[11~13] 与添加银相比，添加铜的抗菌效果更好[14] 银只有在较高的温度下才具有较强的抗菌性能[15]，而铜在模拟体内环境的体外实验中表现出很强的抗菌性能[16]

铜(Cu)元素是人体中必须的微量元素，参与细胞代谢、分化和催化等生理功能[17] 铜也是生物体内多种蛋白和酶的合成组分，在维持人体新陈代谢方面有重要的作用 同时，铜的加入还能提高金属材料的耐蚀性能[18] 本文在目前临床使用的Ti-Zr合金中添加3%(质量分数)的Cu，研究Ti-Zr-Cu合金的抗菌性能和生物相容性

1 实验方法1.1 样品的制备

实验用材料为Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金，其化学成分列于表1 将实验材料(包括空白)切割成直径为10 mm、厚度为2 mm的圆片，依次用150#、400#、800#、1200#碳化硅砂纸打磨 实验前，将空白样品(blank)、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金样品依次用去离子水、75%无水乙醇和100%无水乙醇超声充分清洗，并进行高温高压灭菌

Table 1

表1

表1Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金的化学成分

Table 1Compositions of Ti-Zr alloy and Ti-Zr-Cu alloy (%, mass fraction)

Alloy	Ti	Zr	Cu	Fe	C	O	N	H
Ti-Zr	Bal.	15.20	0.01	0.04	0.05	0.07	0.004	0.002
Ti-Zr-Cu	Bal.	14.50	3.00	0.04	0.04	0.08	0.007	0.002

1.2 抗菌性能的表征

采用平板共培养计数法，使用感染性细菌菌株——革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和革兰氏阴性大肠杆菌(ATCC 8739)评价实验材料的抗菌性能

用蒸馏水配置LB培养基(牛肉膏5 g/L，氯化钠5 g/L，蛋白胨10 g/L)和琼脂培养皿(牛肉膏5 g/L，氯化钠5 g/L，蛋白胨10 g/L，琼脂23 g/L)，调整其pH值为7.2~7.4，并进行高温高压处理 先将两种细菌菌株的冷冻粉溶解在LB培养基中，在温度为37℃的摇床中培养24 h得到细菌悬液 将细菌悬浮液涂布在营养琼脂平皿上，置于温度为37℃、湿度高于90%的恒温培养箱中培养24 h 然后用PBS将细菌菌落配制成浓度为108 cfu/mL的细菌悬液，分别调整大肠杆菌(OD0.150±0.02)和金黄色葡萄球菌(OD0.325±0.02)的光密度，将其浓度稀释为105 cfu/mL

将50 μL稀释后的菌液分别滴加在空白、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金样品的表面，使菌液均匀铺开完全覆盖样品的表面 每组设置4个平行样品，将其放在恒温培养箱中培养24 h 到达时间后, 将样品连同其上的菌液一同移至离心管中，加入3 mL的无菌PBS溶液，涡旋震荡1 min得到洗脱液 取100 μL洗脱液均匀涂布在琼脂培养基的平板上，在恒温培养箱中培养24 h后取出平板拍照 计数每个样品平板上的菌落数，并计算每组样品表面上的平均菌落数 实验材料的杀菌率为

R(%)=(N-N1)/N×100%

(1)

式中N为对照样品表面上的菌落数；N1为实验样品表面上的菌落数 如果R≥90%，则表明实验样品具有强烈的杀菌性能

1.3 生物相容性的表征1.3.1 CCK8细胞增殖

使用空白、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金样品表征细胞增殖，每种材料设置四组平行样品 将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 MC3T3-E1配制成浓度为2×104个/mL的细胞悬液 将空白样、Ti-Zr-Cu合金和Ti-Zr合金各四组平行样品置于48孔板中 用PBS充分清洗样品弃净后，将500 μL/孔细胞悬液均匀滴加在其表面 在37℃、5% CO2条件下，在恒温培养箱(Thermo 公司)中分别培养1 d、4 d和7 d 到达时间点后弃净培养基并用PBS充分冲洗样品表面 在每孔滴加含10%CCK-8的无血清αMEM培养基300 μL，再将其在37℃培养箱中避光孵育4 h，然后每孔取100 μL溶液用酶标仪(Infinite M200型)，测定其在450 nm波长处的光密度(OD)

细胞的相对增殖率(Relative growth rate，RGR)为

RGR(%)=ODTi-Zr-Cu/ODTi-Zr×100%

(2)

式中OD为450 nm处的光密度 根据细胞相对增殖率并依据细胞毒性的分级标准(表2[19])，评价细胞毒性等级

Table 2

表2

表2细胞毒性的分级标准和评定结果

Table 2Grade standard and evaluation result of cytoxicity

Level	RGR/%	Evaluation results
0	≥100	Qualified
1	75~99	Qualified
2	50~74	Overview
3	25~49	Failed
4	0~24	Failed

1.3.2 鬼笔环肽细胞骨架染色

在相同条件下将细胞接种在Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金样品表面，然后放置在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h 到达时间点后弃培养基，将样品取出并移入新的24孔板中，用PBS充分清洗后使用4%多聚甲醛固定10 min 再用PBS清洗并用0.2%TritonX-100 透膜处理 6 min，然后加入罗丹明-鬼笔环肽避光染色40 min 到时间点后用PBS再次充分清洗，随后在避光条件下用DAPI染色5 min 用PBS清洗后，将已固定好细胞的样品置于载玻片上，在Olympus荧光显微镜下观察细胞核及细胞骨架形貌并拍照

1.3.3 细胞凋亡的检测

使用流式细胞仪采用FITC/PI双染法测定细胞凋亡 按照1×104个/cm2的密度将细胞接种在空白、Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金样品表面，然后放在细胞培养箱中培养72 h 到达时间点后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞 用冷PBS缓冲溶液轻吹重悬细胞后，在低于4℃以1000 r/min的转速离心分离5 min后弃液，重复两次后在每管中加入100 μL的Binding Buffer轻吹重悬 然后在每管中依次加入AnnexinV-FITC和PI各5 μL对细胞染色，避光反应15 min后在每管加入400 μL的Binding Buffer，轻吹重悬后在1 h内检测流式细胞凋亡

1.3.4 细胞黏附能力的表征

使用ZEISS场发射扫描电子显微镜(HITACHI-3400N)观察合金样品上的细胞粘附能力 实验接种方法和样品设置，与上述CCK8实验相同 在相同条件下将细胞接种在样品表面，然后放在细胞培养箱中培养168 h，到达时间点后弃去孔板内的培养基并用PBS充分清洗 加入4%多聚甲醛使其没过孔板内样品，然后将其置于4℃的冰箱中固定4 h 到时间后弃去多聚甲醛，再用PBS充分清洗 然后依次用浓度为30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇梯度脱水，每次10 min 最后用100%无水乙醇脱水5 min，重复一次 将其在阴凉处过夜风干，喷金后用扫描电镜观察细胞粘附情况 所有实验都重复3次，取其结果的平均值

采用Graphpad prism 8和IBM SPSS Statistics 23分析实验结果，用单因素方差进行统计学分析，p<0.05表示具有统计学意义

2 结果和讨论2.1 Ti-Zr-Cu合金的抗菌性能

金黄色葡萄球菌(S. aureus)和大肠杆菌(E. coli)分别属于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，是有代表性的两个常见菌种，也是引起骨科感染的常见细菌，因此常选用的菌种评价材料的抗菌性能 采用平板计数法检测Ti-Zr-Cu合金对S. aureus和E. coli的抗菌率，以表征其抗菌性能 图1给出了S. aureus和E. coli分别与Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金共培养24 h后的存活细菌菌落照片，可见空白(blank)对照组和Ti-Zr合金对照组的菌落密集，而Ti-Zr-Cu实验组的菌落数极少 表3列出了各实验组的菌落数和根据式(1)计算出的抗菌率，可见空白样品和Ti-Zr合金没有抗菌性能，而Ti-Zr-Cu合金对S. aureus和E. coli的抗菌率分别达到98.3％和97.7% 这表明Ti-Zr-Cu合金与空白样品和Ti-Zr合金的差异(p＜0.01)显著，意味着Ti-Zr-Cu合金对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较高的抗菌性能

图1



图1金黄色葡萄球菌(S. aureus)和大肠杆菌(E. coli)分别与Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金共培养24 h后存活细菌菌落的照片

Fig.1Photos of colonies of S. aureus and E. coli after co-culture with Ti-Zr alloy and Ti-Zr-Cu alloy for 24 h (a) blank group (S. aureus); (b) Ti-Zr (S. aureus); (c) Ti-Zr-Cu (S. aureus); (d) blank group (E. coli); (e) Ti-Zr (E. coli); (f) Ti-Zr-Cu (E. coli)

Table 3

表3

表3不同材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率(n=4)

Table 3Antibacterial rates of different materials against S. aureus and E. coli (n=4)

Group	S. aureus		E. coli
	Colony mean	Sterilizing rate	Colony mean	Sterilizing rate
Ti-Zr-Cu	5±4.99	(98.28±1.58)%	21±4.69	(97.67±0.49)%
Ti-Zr	294±16.44	—	900±12.96	—
blank	325±18.52	—	1087±43.60	—

Ti-Zr-Cu合金的抗菌性能，源于铜的杀菌作用 铜具有优异的杀菌性能，属于长效广谱的杀菌剂，已经作为一种固体无机抗菌材料注册并列为医用材料[20,21] 因此，铜的加入显著抑制了细菌在Ti-Zr-Cu合金表面的粘附和增殖 研究表明[22]，当细菌与含铜合金共培养时微量铜离子从合金中溶出，在浓度梯度驱动下从合金表面扩散到细菌液中 铜离子通过电荷作用与带负电荷的细菌表面紧密结合，使细菌内外膜电位失衡[23, 24]，从而破坏了细菌的细胞膜,导致细菌死亡 也有研究认为，铜破坏细菌细胞膜的原因，是铜离子通过芬顿反应Cu++H2O2→Cu2++OH-+·OH[25]产生活性氧物种(ROS)，ROS抑制了细菌中的16SrRNA复制并使其死亡[26]

2.2 Ti-Zr-Cu合金的生物相容性2.2.1 Ti-Zr-Cu合金对贴壁细胞增殖的影响

图2给出了CCK8细胞增殖的检测结果 可以看出，培养24 h(1 d)后Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金的OD值都为0.2-0.4，培养96 h后增加到1.5，培养168 h后增加到2.8 由此可见，随着培养时间的增加二种样品的OD值逐渐增大 这表明，MC3T3-E1细胞在Ti-Zr和Ti-Zr-Cu合金表面都能良好地生长 第1天Ti-Zr合金组与Ti-Zr-Cu合金组的细胞增值差异非常显著(p<0.01)，第4天和第7天的差异都不具有统计学意义(p>0.05) MC3T3-E1在Ti-Zr-Cu合金表面1、4、7 d的相对增殖率分别为168.8%、109.8%和106.5%，均大于100%，表明这种合金没有细胞毒性

图2



图2CCK8细胞增值检测给出的MC3T3-E1细胞的 OD值(在450 nm处的吸光度)

Fig.2OD values of MC3T3-E1 cells measured by CCK-8 cell proliferation assay (absorbance at 450 nm)

铜是人体中必需的微量元素之一，是许多物理化学反应和代谢所必需的元素，包括蛋白质合成、酶和红细胞的形成[27] 铜还具有多种生物功能，如刺激血管生成和成骨，以及抑制血栓形成，防止支架再狭窄、减小骨质疏松[28]、抗菌和抗炎[29]等 但是，作为一种重金属元素，过量的铜在体外有细胞毒性，在体内可能会导致肝脏和神经方面的疾病[30, 31] 因此，优化含铜金属的铜含量极为重要 世界卫生组织建议成人每日铜摄入量上限为0.03 mg/kg[32] 铜的质量分数达到0.0141%的铜基合金溶出液，会产生较为明显的细胞毒性[33] 文献[34]的结果表明，Ti-Zr-Cu合金的铜释放量约为0.047 mg/L/day，远小于上述标准 口腔内种植体的体积很小，铜的释放量远低于人体所能承受的每日最大摄入量 因此，Ti-Zr-Cu合金在人体中使用是安全的

2.2.2 Ti-Zr-Cu合金表面的细胞骨架形态

采用罗丹明-鬼笔环肽和DAPI染色检测细胞骨架形态，分别显示出F-肌动蛋白(红色)和细胞核(蓝色)，如图3所示 由图3可见，培养24 h后Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金样品表面的细胞形态没有明显的差异，均呈多边形，没有细胞溶解，细胞的形态完全伸展，伪足多且清晰，细胞核没有明显的改变，能清晰分辨细胞中的微丝微管结构，细胞之间已建立了密切的网状联系 微丝之间良好的接触和形成完整的网络，是细胞进一步增殖的结构基础[35] 细胞在Ti-Zr-Cu合金表面的附着和铺展良好,有利于贴壁细胞在其表面黏附和进一步增值，表明Ti-Zr-Cu合金具有良好的生物相容性

图3



图3MC3T3-E1细胞在Ti-Zr合金(a)和Ti-Zr-Cu合金(b)表面培养24 h后的罗丹明鬼笔环肽骨架染色

Fig.3Rhodamine phalloidin backbone staining of MC3T3-E1 cells on surfaces of Ti-Zr (a) and Ti-Zr-Cu (b) alloys after co-culture for 24 h

2.2.3 Ti-Zr-Cu合金表面的细胞凋亡

使用流式细胞仪检测培养72 h后Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金表面MC3T3-E1细胞凋亡的情况，如图4所示 图4中左下象限(Q3)代表活细胞，右上象限(Q2)代表晚期凋亡细胞及坏死细胞，而右下象限(Q4)为早期凋亡细胞 图4a、b收集到的主要是活细胞 对散点图的统计分析结果在图4c和4d中给出 图4表明，Ti-Zr-Cu合金表面的细胞凋亡率为8%，Ti-Zr合金表面的细胞凋亡率为12.5% 使用spss和graphpad软件分析p大于0.05，表明Ti-Zr-Cu合金对细胞凋亡没有不良的影响

图4



图4MC3T3-E1 细胞在Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金表面培养72 h后的流式散点图和柱状图统计分析

Fig.4Flow scatters and bar graph statistical analyses of MC3T3-E1 cells on Ti-Zr and Ti-Zr-Cu alloys after co-culture for 72 h (a) Ti-Zr alloy; (b) Ti-Zr-Cu alloy; (c) normal cell viability; (d) apotoic cell viability

细胞凋亡受到多基因的调控，其分子生物学机制复杂 调控凋亡的信号传导通路，一是外源性途径，又称为死亡受体凋亡途径；二是内源性途径，又称为线粒体凋亡途径[36] 外源性途径是胞外信号通过细胞膜上死亡受体的介导传入细胞进而启动凋亡[37] 内源性途径是非受体介导的刺激因子启动细胞凋亡，引发细胞内信号作用于胞内靶点，由线粒体发起凋亡[38] 铜的加入，没有影响细胞凋亡，证明其并不影响细胞凋亡相关基因对其凋亡过程的调控；也没破坏细胞正常的结构，表明Ti-Zr-Cu合金没有细胞毒性

2.2.4 Ti-Zr-Cu合金表面的细胞黏附能力

使用扫描电子显微镜(SEM)表征Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金样品的细胞粘附能力，图5给出了培养72 h后样品表面细胞的SEM照片 可以看出，细胞覆盖了二种合金样品的大部分表面，细胞的形态完整，伪足清晰纤长，有大量的丝足和片状脂壁 细胞间通过丝状足孔连接在一起，在样品表面的铺展表现出特定的方向性，且沿表面划痕扩散 这表明Ti-Zr-Cu合金表面有利于MC3T3-E1细胞的黏附和伸展 细胞在Ti-Zr-Cu合金表面的正常粘附，表明其具有良好的生物相容性

图5



图5MC3T3-E1细胞在Ti-Zr合金和Ti-Zr-Cu合金表面培养72 h后的扫描电镜照片

Fig.5Images of scanning electron microscopy of MC3T3-E1 cells on surfaces of Ti-Zr (a) and Ti-Zr-Cu (b) alloys after co-culture for 72 h (200× and 1000×)

3 结论

Ti-Zr-Cu合金对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有优异的抗菌功能，抗菌率分别高达98.3％和97.7% Ti-Zr-Cu合金的抗菌功能，源于在合金中添加了适量的铜 Ti-Zr-Cu合金的生物相容性良好，对成骨细胞无细胞毒性，满足临床应用的要求

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