1.本发明属于环境微生物及生态修复技术领域，具体涉及一株溜曲霉(aspergillustamarii)及其在铅污染土壤修复中的应用。
背景技术：
2.近年来，随着我国经济的快速发展和工业化城市化进程的加快，土壤重金属污染问题日趋严重。据2014年环境保护部和国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，受cd、ni、cu、as、hg、pb等重金属污染的耕地占19.4％，其中，受cd、as、pb等重金属污染的耕地面积达2
×
105km2，约占耕地总面积的1/5。在被污染的农田上耕作，重金属将从土壤转移至农作物当中，在农作物中富集，不但影响农作物的生长与发育，而且会通过食物链进入人体内，从而威胁人体的身体健康。因此，如何防治土壤重金属污染或对重金属污染土壤采用有效的修复措施对于重塑良好的土壤生态做到农业可持续健康发展具有重要的意义。
3.土壤中铅污染现象比较普遍，其来源有两个方面，一是自然来源，主要是火山爆发烟灰的沉降；二是人类活动造成的铅污染，这是也是构成土壤铅污染量大且频繁发生的原因，如含铅矿物的开发、冶炼；蓄电池工业中铅酸电池的使用；燃料油、燃料煤的燃烧废气以及含铅油漆、涂料、颜料、医药等产品的生产和使用。这些污染源中的铅可通过多种渠道进入土壤，从而造成土壤铅污染及其引起的一系列生态问题。因此，如何进行铅污染土壤的修复已引起广泛的关注；目前，铅污染土壤修复技术主要包括物理修复、化学修复和生物修复。物理修复主要是采用客土或换土的方法，即在被污染的土壤上覆盖上非污染土壤或部分或全部挖除污染土壤而换上非污染土壤，但这种方法工程量较大、投资高；化学修复多采用往土壤中投入钝化剂，使重金属的赋存形态发生改变，从而降低铅的生物有效性，但钝化剂的反复使用会破坏土壤性质，造成营养流失、甚至还会产生二次污染的现象。生物修复多采用植物修复法，即通过植物对重金属的吸收、聚集、降解、固定等机制，来清除土壤中的重金属的一种方法，但植物修复作用过程比较缓慢。
4.相比之下，微生物修复法有诸多优点，由于微生物个体小、繁殖快、适应性强，而且部分微生物对重金属就有较强的耐受性，可用于土壤重金属污染的修复。但目前报道的微生物对土壤重金属污染修复机理多依赖微生物的吸附能力，而有关重金属的微生物转化与矿化报道较少，尤其是通过溜曲霉(aspergillus tamarii)对土壤中的铅离子发生矿化作用，从而达到对铅污染土壤的钝化修复未见报道。
技术实现要素：
5.本发明的目的是提供一株溜曲霉及其在铅污染土壤修复中的应用。
6.本发明所提供的溜曲霉为溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33，cgmcc no.40173。
7.所述溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33，已于2022年5月13日保藏于中国微生
物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.40173。
8.所述溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33具有以下特征：
9.温度在28℃下，在psa培养基上生长7d，菌落直径达可达54mm；菌落呈丝绒状，中央部分呈现絮状，颜色偏金色，周围部分呈现土黄色；分生孢子呈黄褐色，形状从球状到椭球状，能产生紫黑色菌核。
10.本发明的有益效果：
11.本发明中的溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33对cu
2+
、pb
2+
、cr
3+
都具有良好的耐受性，在0～5mmol/l的重金属浓度下，都能进行生长与繁殖。
12.本发明中的溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33对pb
2+
具有优异的耐受性，在5mmol/lpb
2+
离子浓度下培养7d，其菌落直径达45mm，培养28d后菌落直径可达51mm；在10mmol/l pb
2+
离子浓度下培养7d，其菌落直径达25mm，培养28d后菌落直径可达48mm。
13.本发明所提供的溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33能将土壤中pb
2+
矿化为含pb矿物，对pb
2+
起到钝化作用。
14.本发明所提供的溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33在含pb
2+
离子20mg/g土壤中处理3个月，铅的固化率达到75.7％。
附图说明
15.图1为溜曲霉bdh33在不同pb
2+
离子浓度培养基上培养28d的生长图。
16.图2为土壤中矿物的x射线晶体衍射(xrd)测定图谱。
17.图3为土壤电子扫描显微镜(sem)及能谱(eds)图。a为对照组原始土壤；b和c为bdh33处理的含铅土壤；a、b和c中的方框为能谱分析区域。
18.图4为溜曲霉bdh33对土壤中pb
2+
的矿化率。
具体实施方式
19.实施例中所用培养基如下：
20.高盐察氏培养基(g/l)：硝酸钠2，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，氯化钠60，蔗糖30，琼脂15，调节ph至7.0-7.2之间。
21.psa培养基(g/l)：马铃薯(去皮)200，蔗糖20，琼脂20。
22.麦芽糖液体培养基(g/l)：麦芽浸粉20，葡萄糖20，蛋白胨6，自然ph。
23.重金属母液：分别配制0.5mol/l的cu
2+
、pb
2+
、cr
3+
、cd
2+
母液。
24.实施例1：真菌菌株的分离、筛选和鉴定
25.1.真菌菌株的分离
26.采集北戴河新河河口沉积物表层5-10cm样品，称取10g沉积物，加入到盛有90ml海水的三角瓶中，混合均匀，静置2h，将上层悬浊液进行10倍的系列稀释至10-4
，每个梯度分别取200μl滴在无菌的培养皿中间，然后将融化后的高盐察氏培养基冷却至50℃左右，按每个培养皿20ml的培养基倒入以上培养皿，迅速转动培养皿，使菌悬液与培养基混合均匀，待培养基凝固后，倒置于28℃的恒温培养箱中培养7d；菌落长出后，挑取不同单菌落转接在psa培养基上，并在同一条件下培养至7d，获得纯培养菌株；将纯培养菌株的菌落刮下，置于
20％的甘油中在-80℃冰箱中保存备用。
27.2.抗重金属真菌的筛选
28.首先配置psa培养基，高压蒸汽灭菌后，分别加入过滤除菌的重金属母液，制成含单一重金属cu
2+
、pb
2+
、cr
3+
和cd
2+
的psa培养基，使其终浓度分别为cu
2+
5mmol/l、pb
2+
5mmol/l、cr
3+
5mmol/l和cd
2+
2mmol/l，然后倒平板，备用。
29.抗重金属真菌的筛选。取1.5ml的离心管，分别加入100μl的无菌水，然后挑取适量纯培养菌株的孢子加入到上述离心管中，混合均匀，配置成菌悬液；然后分别取1μl菌悬液滴在含重金属的psa平板中央，平板倒置放入28℃恒温箱中培养7d，通过量取菌落直径来判断真菌抗重金属的程度，从中筛选具有抗重金属良好的真菌菌株。经上述筛选，得到一株分别能抗cu
2+
、pb
2+
和cr
3+
的菌株bdh33，结果见表1。
30.表1.菌株bdh33在含有不同重金属培养基上的生长直径
[0031][0032]
注：ck为不含有重金属的培养基；
“?”
表示未生长。
[0033]
3.真菌菌株鉴定
[0034]
3.1形态学鉴定。
[0035]
bdh33接种在psa培养基上，28℃下培养7天，菌落直径达可达54mm；菌落呈丝绒状，中央部分呈现絮状，颜色偏金色，周围部分呈现土黄色；分生孢子呈黄褐色，形状从球状到椭球状，能产生紫黑色菌核。
[0036]
3.2分子生物学鉴定。
[0037]
利用真菌的its引物its1:5
’?
tccgtaggtgaacctgcgg-3’和its4:5
’?
tcctccgcttattgatatgc-3’对真菌bdh33的基因组进行pcr扩增。pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和切胶回收纯化后，进行its序列测序，序列如序列表中序列1所示。将该序列在ncbi数据库中进行blast比对分析，结果显示，该菌株的its序列与溜曲霉(aspergillus tamarii)skf8的相似性最高，达99.84％；将该菌株命名为溜曲霉(aspergillustamarii)bdh33。
[0038]
溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33已于2022年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称cgmcc，其地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为no.40173。
[0039]
实施例2：溜曲霉bdh33对pb
2+
离子的耐受能力测定
[0040]
配制含pb
2+
离子浓度分别为5mmol/l、10mmol/l和15mmol/l的psa培养基，倒平板，然后，分别取1μl溜曲霉bdh33的菌悬液点接在不同pb
2+
离子浓度的psa平板中央，置于28℃的恒温箱中培养，并于2d、5d、7d、14d、21d和28d观察和记录其生长情况。
[0041]
结果如表2所示，当pb
2+
离子浓度为5mmol/l时，接种后的第2d菌株开始生长，在随后的5～14d其生长速度较快，到21～28d时，菌落直径为51mm，基本不再生长。当pb
2+
离子浓度为10mmol/l时，接种后的第5d才开始生长，在随后的7～21d内菌株生长较快，到28d时，菌落直径达48mm。但当pb
2+
离子浓度增加到15mmol/l时，即使培养到第28d也未见其生长，由此可确定溜曲霉bdh33对pb
2+
离子的耐受上限浓度为10～15mmol/l。
[0042]
表2.溜曲霉bdh33的生长动态及对pb
2+
离子的耐受测定
[0043][0044]
注：表中数据为菌落直径(mm)；
“?”
表示未生长。
[0045]
通过以上观察还发现，随着pb
2+
离子浓度的增加，溜曲霉bdh33生长在平板上的菌落生物量逐渐减少，如图1所示，虽然溜曲霉bdh33在5mmol/l和10mmol/l pb
2+
培养基上培养28d时的直径差别不明显，但其生物量差异显著，在10mmol/l pb
2+
培养基上的生物量约为5mmol/l pb
2+
培养基上生物量的五分之一；但在15mmol/l pb
2+
培养基上，未见溜曲霉bdh33生长，其生物量为0。
[0046]
实施例3：溜曲霉bdh33对pb
2+
离子的矿化与修复效果
[0047]
1.含pb
2+
土壤的真菌修复实验
[0048]
实验用土壤的准备。取土壤若干，过1mm孔径的圆孔筛，留取1mm粒径以下的土壤，装入250ml锥形瓶中，每瓶100g土壤。
[0049]
pb
2+
溶液的配制。吸取1.5ml的0.5mol/l的pb
2+
母液，加入到73.5ml的麦芽糖液体培养基中，配制成pb
2+
离子终浓度为10mmol/l的麦芽糖溶液。
[0050]
含pb
2+
土壤的真菌修复实验。将含pb
2+
离子的麦芽糖溶液75ml加入到上述100g土壤中，摇动混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌30min，灭菌完成后接入100μl的溜曲霉bdh33孢子悬液，摇动三角瓶，充分混匀，以不接真菌的含pb
2+
土壤为对照，于室温下进行培养，每间隔10d摇动三角瓶一次，培养120d结束实验。
[0051]
2.土壤中矿物的测定
[0052]
x射线晶体衍射(xrd)分析。实验结束后，从三角瓶中取约5～10g的土壤放入培养皿内，于室温下自然风干，风干的土壤样品用玛瑙研钵研磨成粉末，然后进行xrd测试。测试条件为：30kv，10ma，2θ扫描角度＝10
°
～70
°
，扫描速度＝6
°
/s。获得的x射线晶体衍射图谱用jade 6软件进行物相检索和分析。
[0053]
土壤中矿物的xrd测定见图2，结果显示，无论是对照组土壤(含铅、未接种bdh33)还是实验组土壤(含铅、接种bdh33)，其矿物组成主要包含了钙长石、石英、方解石、草酸钙等矿物。但接种了溜曲霉bdh33的土壤的xrd图谱在2θ角度27
°
～29
°
之间图谱出现明显的区别，推测含铅土壤在溜曲霉bdh33的作用下形成了新的含铅矿物；但由于土壤中加入的pb
2+
的量为1.55mg/g，因此新形成的含铅矿物量与土壤中其他矿物的量相比非常少，致使其矿物晶体衍射峰较弱，难以检索和区分它们是何种矿物，因此借助以下分析手段对其进行了分析。
[0054]
3.土壤中矿物的观察与分析
[0055]
电子扫描显微镜(sem)和能谱(eds)观察与分析。将对照组原始土壤和实验组土壤进行电镜制样，为获得清晰的电子图像，需要在样品上喷pt，以增强样品的导电性。将样品放入电子扫描显微镜中，采用15kv的加速电压，在背散射条件下观察含铅矿物，并用x射线
能谱分析仪(eds)对矿物中的元素进行定性和半定量分析。
[0056]
结果见图3，在背散射电子图像中，含铅矿物往往呈亮色。由图中可以看出，对照组原始土壤呈暗色，能谱结果显示土壤中的元素主要包括了c、o、si、al等；而经bdh33处理的含铅土壤的背散射电子图像中，出现明暗程度不一的土壤矿物，分别对明暗不同的土壤矿物进行能谱元素分析，结果显示暗色土壤矿物中的元素主要有c、o、si、al等元，与对照组原始土壤相似；而明亮土壤矿物中的元素主要含有c、o和pb等，其中pb元素的相对质量百分数为86.32％，可见经bdh33处理后，土壤中的pb
2+
已被矿化为富含铅的矿物颗粒，根据其元素组成及该类菌的特性，推测该矿物为有机含铅矿物。
[0057]
4.土壤中pb
2+
的矿化率
[0058]
土壤经处理30d、60d、90d和120d时分别取样，取适量土壤放在鼓风干燥箱中进行干燥，各取1g土壤于15ml离心管中，加入12ml去离子水，充分涡旋混匀，然后离心收集上清液(10.8ml)，采用icp-ms电感耦合等离子体质谱法测定上清液中pb
2+
离子的浓度，然后计算土壤中pb
2+
的矿化率。矿化率(％)＝(c
0-c
t
)/c0*100％，式中c0为土壤中pb
2+
的初始含量(mg/g)；c
t
为真菌处理后土壤中pb
2+
的含量(mg/g)。
[0059]
结果见图4，含pb
2+
土壤经溜曲霉bdh33处理30d、60d、90d和120d后，土壤中游离态pb
2+
的含量分别为1.85、1.03、0.68和0.59mg/g，与土壤中pb
2+
的初始含量2.43mg/g相比，其矿化率分别为23.9％、57.6％、72.0％和75.7％。由此可见，溜曲霉bdh33是一株耐受高浓度铅、且能将pb
2+
矿化为固体含铅矿物的菌株，在铅污染土壤的钝化修复应用中具有广阔的前景。
[0060]
以上所述仅为本发明的示意性实施方式，并不用于显示本技术的范围；对于本领域的技术人员来说，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围之内，所做的任何修改、变化或等效，均落入本发明的保护范围内。技术特征：
1.一种溜曲霉，其特征在于，其名称为溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.40173。2.一种微生物制剂，其活性成分为权利要求1所述的溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33。3.权利要求1所述的溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33在重金属污染土壤修复中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重金属包括：cu
2+
、pb
2+
、cr
3+
；更为优选的，所述重金属为pb
2+
。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重金属污染土壤pb
2+
离子范围为0～2.43mg/g的土壤。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重金属污染土壤中的矿物包含石英、钙长石、方解石和草酸钙等。7.权利要求1所述的溜曲霉(aspergillus tamarii)bdh33在矿化pb
2+
离子中的应用。
技术总结
本发明公开了一株溜曲霉(Aspergillus tamarii)及其在铅污染土壤修复中的应用。该菌株已于2022年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.40173。本发明分离筛选到的溜曲霉(Aspergillus tamarii)对多种重金属、特别是Pb
技术研发人员：魏士平 陈俊清
受保护的技术使用者：中国地质大学（北京）
技术研发日：2022.11.30
技术公布日：2023/5/5
声明：
“溜曲霉及其在铅污染土壤修复中的应用” 该技术专利(论文)所有权利归属于技术(论文)所有人。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系该技术所有人。
我是此专利(论文)的发明人(作者)
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编辑：中冶有色技术网
来源：中国地质大学（北京）
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2024年07月05日 ~ 07日 
