本发明属于微生物菌剂制备领域，涉及应用于水体氨氮降解的硝化菌的富集及菌剂的制备方法。
背景技术：
随着工农业的快速发展，水体中氨氮污染已不容忽视。氨氮对于水体生态危害较大，其浓度过高不仅会造成水体富营养化，形成湖泛，而且其所形成的游离氨具有较强毒性，对水生生物以及人类健康都有着巨大危害。
水体中的氨氮可通过氨氧化菌氧化生产亚硝酸根，继而再通过硝化菌氧化生成硝酸根。根据最新的研究结果，水体中的氨氮也可通过“全程氨氧化菌”直接氧化生成硝酸根。参与氨氮硝化过程的微生物大多为化能自养菌，且多数为不可纯培养类型。虽然化能自养菌代时长，生长缓慢，发酵培养障碍多且难度大，但由于其高效的单体硝化速率，且不依赖有机碳源的浓度，因此化能自养型硝化菌十分适合自然水体氨氮降解。化能自养型的氨氧化微生物包括氨氧化细菌和氨氧化古生菌，而自养型的硝化菌则主要由硝化球菌和硝化杆菌等类群。他们都以二氧化碳为碳源，通过氧化氨氮或亚硝酸盐获得能量进行生长代谢。虽然化能自养菌类的硝化菌具有降解速率快，无需有机碳等多个优点，但由于其能量利用率较低，代时长，增长慢，其产量或许很难满足水质改善的工程使用。
对于异养类型的微生物来讲，如芽孢杆菌等，他们通过同化作用，吸收环境中的碳源和氮源，从而达到降低水中氨氮的目的。虽然这些微生物单体氨氮去除速率较化能自养类型的硝化菌慢很多，且需要吸收有机碳，但这类微生物代时短，产量大，非常适合目前大规模水环境生态治理工程的需求。
对于微生物生长来说，碳氮比是一个关键的影响，根据微生物细胞元素组成，其碳氮比大约为16:1，而且碳源物质还要参与呼吸代谢，供给能量。如果环境中营养物质碳氮比较低的话，则会造成菌体代谢缓慢，当碳源消耗完毕后，环境中仍剩余氮源无法被同化吸收。
污水处理工艺中，也常通过添加碳源(如乙酸钠等)来降解含氮物质。
自然水体(河道、湖泊)由于收到污染输入的影响，其碳氮比范围较大。对于碳氮比较高的水体，通过异养同化类菌剂的投加，结合曝气便可有效去除cod(化学需氧量)以及总氮。而对于碳氮比较低的水体，异养菌受碳源浓度较低制约，不利于氨氮的去除。自养类的硝化菌便可发挥其代谢特点，同化大气中二氧化碳作为碳源，持续的氧化氨氮，去除水体污染。
常见的硝化菌剂大多为单一菌种或由几种纯菌复配而成。菌株确定的微生物制剂便于发酵生产以及品质控制，但就氨氧化及硝化功能来讲，共生菌群所达到的效果要强于单一菌株。例如氨氧化古生菌在环境中参与了较高比例的氨氧化，但由于其缺乏三羧酸循环中一些必需酶，因而其生长代谢需要其他菌体为其代谢产生相关中间代谢产物。另外，自然水体(河道、湖泊)不同于反应器，很多理化条件不可控，且存在较多变量，纯菌可能受限于复杂多变的自然环境，且在发酵生产过程中易污染杂菌，使得工艺制备程序繁琐及成本的提高。
技术实现要素：
针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种简便、高效的地表水环境氨氮去除方法，该方法应对不同水体状况针对性地应对不同碳氮比水体环境。
为达到上述目的，本发明地表水环境氨氮去除方法，包括下述步骤：检测富营养化水体水质的碳氮比；
如果检测出的碳氮比小于预定值，则使用上述权方法制备的第一硝化菌群和第二硝化菌群联合使用；
如果检测出的碳氮比大于预定值，则使用上述方法制备的的第一硝化菌群和第三硝化菌群联合使用。
较佳的，所述的第一硝化菌群是按下述方法制备的：
1)采集自然水体中的底泥,制作成底泥悬浊液；
2)用第一硝化菌群富集培养基中加入所述的底泥悬浊液。
3)重复4-8次下述的富集培养步骤：
3-1)震荡培养3-10天后，弃上清后保留沉淀；
3-2)在沉淀物中再次加入第一硝化菌群富集培养基；
3-3)返回步骤3-1；
4)弃上清后保留的沉淀为第一硝化菌群。
较佳的，所述的第一硝化菌群富集培养基是在自来水中加入下述原料制成的：
乙酸钠0.1-0.5g/l，碳酸氢铵0.1-0.5g/l，kh2po40.01-0.1g/l，mgso40.01-0.05g/l，nacl0.02-0.07g/l。
较佳的，所述的第二硝化菌群是按下述方法制备的：
1)在第二硝化菌群富集培养基中加入第一硝化菌群
2)重复4-8次下述的富集培养步骤：
2-1)震荡培养3-10天后，弃上清后保留沉淀；
2-2)在沉淀物中再次加入第一硝化菌群富集培养基；
2-3)返回步骤2-1；
3)弃上清后保留的沉淀为第二硝化菌群。
较佳的，所述的第二硝化菌群富集培养基是在自来水中加入下述原料制成的：
nh4hco30.1-0.5g/l，kh2po40.01-0.05g/l，mgso40.02-0.08g/l，nacl0.01-0.1g/l。
较佳的，所述的第三硝化菌群是按下述方法制备的：
将富集得到的第一硝化菌，在牛肉膏蛋白胨固体平板上进行单菌落分离；将挑取的单菌落接种于氨氮降解检测培养基中，摇床震荡培养24h检测氨氮浓度；挑取若干氨氮下降大于预定值的的菌种作为第三硝化菌群。
较佳的，所述的氨氮降解检测培养基是在水中加入下述原料制成的：乙酸钠0.5g/l，氯化铵0.1g/l，kh2po40.05g/l，mgso40.05g/l，nacl0.05g/l，mnso40.01g/l，feso40.01g/l。
本发明的方法可以针对性地应对不同碳氮比水体环境,降解水体中氨氮浓度。
附图说明
图1为本发明氨氮去除方法的流程图。
图2为硝化菌的富集分离方法路线图
图3：不同浓度氨氮对降解速率的影响
图4不同碳源对氨氮降解的影响图。
图5为第一硝化菌富集驯化第二硝化菌的氨氮浓度变化。
具体实施方式
本发明的地表水环境氨氮去除方法包括下述步骤：
根据富营养化水体水质指标特征，按照碳氮比等于2为界限。对于碳氮比小于2的水体，氨氮去除的硝化菌可使用第一硝化菌和第二硝化菌按照一定的比例联合使用，且随着碳氮比降低，第二硝化菌的比例则相应提高。对于碳氮比大于2的水体，氨氮去除的硝化菌可使用第一硝化菌和第三硝化菌按照一定的比例联合使用，且随着碳氮比不断提高，第三硝化菌的比例也相应提高。
其中，上述的第一硝化菌群富集分离及制备方法；
第一硝化菌群富集培养基：乙酸钠0.1-0.5g/l，碳酸氢铵0.1-0.5g/l，kh2po40.01-0.1g/l，mgso40.01-0.05g/l，nacl0.02-0.07g/l(使用自来水配置，无需灭菌)。
采集适量自然水体(如河道、湖泊)中的底泥,制作成底泥悬浊液。在锥形瓶内加入适量的第一硝化菌群富集培养基，并加入一定量的底泥悬浊液。以120-180rpm，在25-35℃条件下放置于摇床进行震荡培养。培养过程需要在避光条件下进行。一方面由于光照可能会阻碍硝化菌的生长代谢，另一方面由于培养容器及培养基没有经过灭菌处理，光照可能会导致藻类生长，使得碳氮源被吸收，影响目标菌群的生长。
培养以培养基中氨氮浓度降至2mg/l以下为终点，大约需要3-10天(起始的天数较长，后期时间会缩短)。培养结束后，沉淀弃上清，添加新的第一硝化菌群富集培养基，继续重复富集培养过程4-8轮。并且在后续培养过程中，逐渐降低培养温度(直至温度降至15-20℃)，逐渐降低乙酸钠的浓度(直至浓度降至0.1g/l)，并且在培养结束后氨氮可降至2mg/l以下视为驯化结束。最终获得的沉淀即为第一硝化菌群。
第一硝化菌群是一个菌群复合体，既包含有化能自养硝化菌，也包括异养通化氨氮，亚硝酸盐的化能异养菌，对于氨氮浓度及碳氮比有较强的适应性。第一硝化菌可以通过连续流加培养或补料的方式进行培养制备，培养基采用第一硝化菌群富集培养基(适当降低碳氮比及碳酸氢铵浓度)。
第二硝化菌群富集分离及制备方法；
第二硝化菌群富集培养基：nh4hco30.1-0.5g，kh2po40.01-0.05g，mgso40.02-0.08g，nacl0.01-0.1g(使用自来水配置)
第二硝化菌群是化能自养微生物类群，其新陈代新不需要有机碳，完全依靠氨氮氧化产生化学能，同化二氧化碳进行生长。因为第一硝化菌群中也含有化能自养硝化菌，故由第一硝化菌群开始第二硝化菌群的富集会更省时。
取适量的第一硝化菌，添加至装有第二硝化菌群富集培养基的锥形瓶内，以15-20℃，120-180rpm在恒温摇床上进行震荡培养，至培养基中氨氮浓度降至2mg/l以下，离心沉淀弃上清，更换新的第二硝化菌富集培养基，并重复几轮富集培养操作。最终得到的沉淀便是第二硝化菌群。
第二硝化菌是化能自养微生物，需通过连续流加补料的培养方式进行生产，培养基需要使用无机氮源且不含有机碳源。可使用第二硝化菌群富集培养基进行生产，并且根据氨氮浓度的变化，定时补充一定量的碳酸氢铵。
第三硝化菌的分离及制备方法；
第三硝化菌是化能异养型微生物，主要靠同化吸收铵盐，亚硝酸盐的方式进行氨氮降解。因为第一硝化菌群中也含有化能异养硝化菌，故由第一硝化菌群开始第三硝化菌的分离会更省时。
取适量富集得到的第一硝化菌，在牛肉膏蛋白胨固体平板上进行单菌落分离，挑取适量的单菌落接种于氨氮降解检测培养基中，摇床震荡培养24h检测氨氮浓度，挑取若干氨氮下降较高的菌种作为第三硝化菌使用。
(牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl5.0g/l，琼脂15-25g/l；
氨氮降解检测培养基：乙酸钠0.5g/l，氯化铵0.1g/l，kh2po40.05g/l，mgso40.05g/l，nacl0.05g/l，mnso40.01g/l，feso40.01g/l)
第三硝化菌是异养类型的微生物，该类群的培养基需要经过高温灭菌，其发酵生产可使用发酵罐。其发酵培养基可使用合成培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl5.0g/l)、lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l)，或者使用半合成培养基(含有糖蜜,玉米浆,氯化钠,牛肉膏，总碳：总氮为16:1)。当一批发酵结束后收集发酵菌液作为第三硝化菌菌剂。
菌剂生物量检测
该发明所富集得到的硝化菌通过菌体体积和菌液吸光度作为生物量定量指标。
1、菌体体积：将培养得到的菌液混匀，之后在自然状态下静置10分钟，此时容器底部沉淀的菌体体积作为菌量的定量指标(适用于第一硝化菌和第二硝化菌)。
2、吸光度：取未加菌的培养液作为空白对照，使用分光光度计测定发酵菌液在660nm波长时的吸光度。吸光度随着菌浓度的升高而增大，a660可作为硝化菌量的定量指标(适用于第三硝化菌)。
各菌剂特性分析实验
实验1：温度对第一硝化菌降解效率的影响
表1：温度对第一硝化菌氨氮降解率的影响
取250ml锥形瓶若干，加入150ml模拟废水(其中氯化铵0.1g/l，乙酸钠0.2g/l,碳氮比为2.2)。在恒定转速(120-180rpm)，不同温度(分别设置25℃，20℃，15℃和10℃)的状态下，将锥形瓶放置于恒温震荡摇床内培养，各瓶内添加体积比1‰的第一硝化菌,在处理20h后，测定其氨氮浓度，并计算氨氮降解率。
经处理20h后，降解率和温度呈正相关。在15℃时，第一硝化菌仍然有72％的氨氮降解率；当温度降至10℃时，降解率只有47％。
实验2：第一硝化菌不同菌量对降解率的影响
表2：第一硝化菌不同菌量对氨氮降解率的影响
取250ml锥形瓶若干，加入150ml模拟废水(其中氯化铵0.1g/l，乙酸钠0.2g/l,碳氮比为2.2)。在恒定转速(120-180rpm)，恒定温度(20℃)的状态下，将锥形瓶放置于恒温震荡摇床内培养，各瓶内添加梯度体积比的第一硝化菌(分别设置添加量为体积比1‰、0.8‰、0.6‰、0.4％和0.2％),在处理20h后，测定其氨氮浓度，并计算氨氮降解率。
经处理20h后发现，降解率随着添加量的减少而降低，但降低并不显著。第一硝化菌的添加量为0.4‰时，其降解率相比1‰的添加量只下降了5个百分点；当添加量降至0.2‰，相比1‰的添加量只下降了不到7个百分点，降幅并不显著。因而对于菌剂的添加量，维持在一个相对较低的水平仍然能够取到较好的效果，可以降低生产及运输费用。
实验3：第一硝化菌对不同浓度氨氮的降解速率差异
取250ml锥形瓶若干，加入150ml模拟废水(其中氯化铵为梯度浓度，乙酸钠0.2g/l)。在恒定转速(120-180rpm)，恒定温度(20℃)，恒定第一硝化菌添加量(0.8‰)的状态下，将锥形瓶放置于恒温震荡摇床内培养。不同锥形瓶内添加梯度浓度的氯化铵(氨氮浓度分别为：1号样品25.7mg/l，2号样品21.4mg/l，3号样品17.1mg/l，4号样品12.9mg/l,5号样品8.6mg/l,6号样品4.3mg/l),在处理20h后，测定其氨氮浓度，并计算氨氮降解率速率。
经过20h处理后，发现各摇瓶内氨氮浓度均有下降，但随着氨氮浓度降低，其降解速率也随之降低。在设定的氨氮浓度范围内，第一硝化菌的降解速率范围在0.23-1.04mg/l﹒h。如图3所示的不同浓度氨氮对降解速率的影响。
实验4：第一硝化菌碳氮比
表3：不同碳氮比对氨氮降解率的影响
取250ml锥形瓶若干，加入150ml模拟废水(其中氯化铵0.1g/l，乙酸钠设置为梯度添加量，浓度范围为0.05-0.5g/l)。在恒定转速(120-180rpm)，恒定温度(20℃),恒定第一硝化菌添加量(0.8‰)的状态下，将锥形瓶放置于恒温震荡摇床内培养。在处理20h后，测定其氨氮浓度，并计算氨氮降解率。
经过20h处理后，发现各摇瓶内的氨氮浓度均有下降。但随着乙酸钠浓度的增加(碳氮比升高)，氨氮降解率也随之上升，但在碳氮比2.2以上时，其降解率接近最大值，增幅已不再显著。第一硝化菌是化能自养菌和异养菌的混合菌群，可以通过驯化分别富集出两类不同的硝化菌，因而碳氮比在2左右可认为是一个分界点。碳氮比过低时，第一硝化菌的氨氮降解效率会显著下降，该水体更适合化能自养菌(第二硝化菌)的处理；而碳氮比较高时，虽然第一硝化菌有较好的效果，但考虑功能菌的生物量，异养类型的第三硝化菌则更加合适。
实验5：第一硝化菌的碳源利用实验
图4不同碳源对氨氮降解的影响图。取250ml锥形瓶若干，加入150ml模拟废水(其中氮源为氯化铵0.1g/l，碳源采用不同物质，如可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、柠檬酸钠和乙酸钠，并将其cod的量调至统一)。在恒定转速(120-180rpm)，恒定温度(20℃),恒定第一硝化菌添加量(0.8‰)的状态下，将锥形瓶放置于恒温震荡摇床内培养，并测定其氨氮浓度变化。
在处理24h和48h时，测定各组氨氮浓度，发现添加可溶性淀粉的处理组，氨氮降解最慢；甘油和葡萄糖的处理组在24h时氨氮降解并不显著，但在48h时有较大的削减；柠檬酸钠和乙酸钠的处理组中氨氮在24h后便有较为显著的削减。
第一硝化菌是一类多种微生物的混合体，乙酸钠和柠檬酸钠均属于三羧酸循环中的中间代谢产物，因而这些碳源可以更好的被微生物利用，继而同化氨氮；甘油和葡萄糖可以通过简单的代谢，生成三羧酸循环的中间代谢产物，其代谢过程相比乙酸钠和柠檬酸钠多了几步；可溶性淀粉被无法被微生物直接利用，需要淀粉酶将淀粉断链，水解为葡萄糖，之后才能被微生物利用。第一硝化菌可能缺少产淀粉酶的微生物，因而可溶性淀粉处理组的氨氮降解率最低。
在后期工程应用时，如果含有一些特殊的有机物污染(如油脂等)，根据第一硝化菌的特点，可以补加产相应功能酶的微生物或酶制剂，达到污染物去除的目的。
实验6：通过第一硝化菌驯化富集第二硝化菌的过程
图5为第一硝化菌富集驯化第二硝化菌的氨氮浓度变化图。第一硝化菌是一类多种微生物的混合体，包含化能自养型硝化菌及异养类型的硝化菌。通过进一步的驯化富集，可以从第一硝化菌中富集得到化能自养型的硝化菌。
在一5l的发酵罐内，添加4l的第二硝化菌培养基(不含有机碳源，氮源为碳酸氢铵0.15g/l),添加体积比为1-10‰的第一硝化菌进行驯化富集培养。在富集培养过程中每天测定其氨氮浓度，当氨氮浓度降至1mg/l左右时，补加碳酸氢铵600mg，重复该培养过程。通过记录氨氮浓度变化可发现，氨氮浓度的削减速率逐渐提高，在培养1个月时，补加氮源24后就基本降解完全，由于培养基中并不含有有机碳，因而发挥功能的是化能自养型的硝化菌。氨氮降解速率逐渐加快，也证明了化能自养菌的比例在逐渐升高。第二硝化菌可以通过连续培养的发酵方式进行生产。
实验7：第三硝化菌对于低碳氮比水体氨氮的降解实验
表4：第三硝化菌处理低碳氮比水体的氨氮浓度变化
在一20l的水桶内配置模拟低碳氮比的废水(碳氮比为1.5，氨氮浓度为32.8mg/l)。在桶内底部布设曝气盘管，曝气量为10l/min，每天曝气约12h。在室温状态下，按体积比1-5‰投加第三硝化菌，并在处理7天、13天时记录其氨氮浓度。
第三硝化菌是异养类型的微生物，其氨氮去除的原理是在同化有机碳的同时，吸收降解氨氮。虽然该实验模拟废水的碳氮比较低，但第三硝化菌的发酵液中含有较高浓度的碳源，投加菌剂的同时，足量的碳源也随之进入水体，因而使得同化作用进行，氨氮浓度降低。在投加第三硝化菌的13天后，氨氮浓度由起始的32.8mg/l降至1.3mg/l。
由于代谢的特点，第三硝化菌更适合高碳氮比水体的氨氮去除。但对于低碳氮比水体来说，也可以通过发酵液整体投加，利用发酵液中剩余的有机物，达到补充有机碳源，促进氨氮同化的目的。
技术特征：
技术总结
本发明公开一种地表水环境氨氮去除方法。所述的方法包括下述步骤：检测富营养化水体水质的碳氮比；如果检测出的碳氮比小于预定值，则第一硝化菌群和第二硝化菌群联合使用；如果检测出的碳氮比小于预定值，则第一硝化菌群和第三硝化菌群联合使用。本发明的方法可以降解水体中氨氮浓度，针对性地应对不同碳氮比水体环境。
技术研发人员：孟溪;程寒飞;骆守鹏;赵丹
受保护的技术使用者：中冶华天工程技术有限公司;中冶华天南京工程技术有限公司
技术研发日：2017.10.19
技术公布日：2018.02.02
声明：
“地表水环境氨氮去除方法与流程” 该技术专利(论文)所有权利归属于技术(论文)所有人。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系该技术所有人。
我是此专利(论文)的发明人(作者)
938
编辑：中冶有色技术网
来源：中冶华天工程技术有限公司;中冶华天南京工程技术有限公司
分享 0
举报 0
收藏 0
反对 0
点赞 0
中冶有色技术平台
2024年07月25日 ~ 27日 
