土壤中双酚A及其十三种结构类似物的同步测定方法

土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法

技术领域

1.本发明属于新型有机污染物的检测领域，具体涉及为一种加速溶剂萃取结合超高效液相色谱?串联质谱同时测定土壤中双酚a及其结构类似物的方法。

背景技术：

2.近几十年来，双酚a(bisphenol a，bpa)这种被广泛使用的酚类塑化剂，被大量用于聚碳酸酯塑料、环氧树脂和酚醛树脂的生产，被用于制造各种消费品，如塑料食品包装产品、罐衬里、婴儿奶瓶、医用管、眼镜镜片以及热敏纸等。作为一种典型的内分泌干扰物质(edc)，bpa通过模拟干扰荷尔蒙活性，破坏生长、发育和繁殖，对生态系统和人体健康产生不利影响。也有报道称bpa可以干扰苜蓿和根瘤菌之间的信号传导，导致固氮能力下降。大量的结构类似物随着对bpa使用监管的加强被当作其替代品。比如双酚s(bisphenol s，bps)是bpa热敏纸以及环氧树脂生产中的替代品，双酚af(bisphenol af，bpaf)、双酚f(bisphenol f，bpf)在聚碳酸酯的生产中被用作替代品，双酚b(bisphenol b，bpb)在酚醛树脂的生产中被用作替代品。这些替代品因为与bpa具有相似的结构而具有类似的理化性质和毒理学特征，也会和bpa一样对生态系统和人类健康造成威胁。

3.目前，已经在水体、污泥、灰尘等环境介质中广泛检测到双酚的存在，但是没有涉及到土壤中多种双酚类似物的定量研究。而土壤作为bpa及其类似物的重要的汇，它们可能通过直接废水排放、污泥施用、相关固体废物的处置和回收以及塑料农膜的使用等方式进入土壤，对土壤生态产生影响，并经食物链对人类健康造成危害。此外，随着化学工业继续开发更多的双酚a替代品，在监测项目中增加双酚类化合物的数量是必要的。因此，需要对土壤中多种双酚进行准确定量，然而，由于土壤介质相对比较复杂，且双酚在土壤样品中的浓度多处于痕量或超痕量水平，对于它们的准确定量分析成为研究的难点，目前为止，也没有相关分析方法的发表。

4.目前最常用的提取土壤中有机物的方法有超声提取法(ultrasound extraction，use)、索氏提取法(soxhlet extraction)、固液萃取法(solid fluid extraction，sle)、加速溶剂萃取法(accelerated solvent extraction，ase)等。但是土壤中含有大量腐殖质、各种污染物以及色素，这将会严重损伤仪器设备，还将影响目标物质的检测。因此，样品提取后需要进行净化处理，常见的技术手段有在线净化(purify online)和固相萃取(solid phase extraction，spe)。痕量有机物的定量通常用到气相色谱?质谱法(gas chromatography?mass spectrometry，gc?ms)，气相色谱?串联质谱法(gas chromatography?tandem mass spectrometry，gc?ms/ms)，液相色谱?质谱法(liquid chromatography?mass spectrometry，lc?ms)，液相色谱?
串联质谱法(liquid chromatography?tandem mass spectrometry，lc?ms/ms)等。由于一组结构类似物具有相似的理化性质，因此进行定量分析时如何将其完全色谱分离是技术难点。

技术实现要素：

5.本发明要解决的问题是提供一种同时提取、同时净化以及同时检测土壤样品中双酚a及其13种结构类似物的一体化方法，旨在节约检测的时间成本和经济成本，对于该类有机物在土壤介质中的定量以及后续相关研究具有重要意义。

6.为了解决上述技术问题，本发明提供一种土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法(即，使用加速溶剂萃取结合超高效液相色谱?串联质谱同步高效测定土壤中双酚a及13种结构类似物的方法，可同时快速分析土壤中14种双酚类物质的uplc?ms/ms定量方法)，包括如下步骤：

7.(1)样品制备：

8.收集的土壤样品除杂混匀后进行干燥脱水(至含水率小于1％)，过筛，备用；

9.具体为：过2mm筛，然后用研钵和研棒研磨至过100目筛的均匀粉末，置于琥珀色玻璃小瓶中保存在4℃条件下备用；

10.(2)样品提取及净化：

11.2.1)、称取1克步骤(1)土壤进行加速溶剂萃取，并进行在线净化，得到提取液；

12.2.2)、将提取液浓缩至0.5

±

0.1ml，并用甲醇定容至1

±

0.1ml，得浓缩液；

13.2.3)、使用超速离心机对浓缩液进行离心除去微小的杂质，收集上清液；

14.(3)样品检测：将上清液中的土壤中双酚a及其十三种结构类似物(简称14种双酚)用超高效液相色谱

?

串联质谱法进行定性定量分析。

15.其中，根据色谱峰保留时间、目标物的特征离子以及其丰度比进行定性，加入进样内标定量。

16.除了双酚a(bisphenol a，bpa)之外，13种双酚a的结构类似物为：双酚p(bisphenol p，bpp)、双酚m(bisphenol m，bpm)、双酚af(bisphenol af，bpaf)、双酚e(bisphenol e，bpe)、双酚ph(bisphenol ph，bpph)、双酚ap(bisphenol ap，bpap)、双酚f(bisphenol f，bpf)、双酚s(bisphenol s，bps)、双酚b(bisphenol b，bpb)、双酚fl(bisphenol fl，bpfl)、双酚tmc(bisphenol tmc，bp

?

tmc)、双酚bp(bisphenol bp，bpbp)、双酚z(bisphenol z，bpz)。

17.作为本发明的方法的改进：

18.所述步骤(1)中的干燥为冷冻干燥，即土壤样品干燥是在labconco真空冷冻干燥机中进行的。

19.作为本发明的方法的进一步改进：

20.所述步骤2.1)中：加速溶剂萃取过程中需使用34ml的不锈钢萃取池，在其底部垫入cellulose ase萃取膜，从底部向上依次填入2g硅藻土，3g中性氧化铝，空白土壤和硅藻土等质量比的混合物，用量2g(防止土壤板结)，加入混合标样(100ng g

?1)和氘代内标(100ng g

?1)，最后用石英砂铺满萃取池；

21.用甲醇

?

丙酮酸性混合溶剂作加速溶剂萃取的萃取剂，萃取过程在以下条件下运行：80

?

150℃，1500psi平衡压力，加热时间5

?

7min，静态提取时间5min，2

?

5个循环，漂洗量60％和吹扫时间100s；

22.甲醇

?

丙酮酸性混合溶剂，即，甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸，制备方法为：甲醇和丙酮按1/1的体积比混合，然后加入上述混合液体积1％的甲酸作为添加剂；

23.每个样品设置3个重复，最后结果取平均值，减少系统误差。

24.作为本发明的方法的进一步改进：

25.所述步骤2.2)中，浓缩方法为减压旋蒸浓缩，将加速溶剂萃取后收集到的提取液在heidolph旋转蒸发器中55℃的水浴中减压旋蒸浓缩至0.5

±

0.1ml，然后用甲醇定容至1

±

0.1ml。

26.作为本发明的方法的进一步改进：

27.所述步骤2.3)中，将浓缩液倒入2

?

ml离心管中，在超速离心机中以2500g的速度离心10min后，取上清液至waters自动进样器样品瓶中，以待后续定量。

28.作为本发明的方法的进一步改进：

29.所述步骤(3)中，液相色谱的条件为：

30.液相色谱柱：acquity beh phenyl(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；柱温40℃；

31.在二元溶剂管理器前，使用较短的uplc色谱柱(acquity beh c18，2.1mm

×

50mm，1.7μm)作为捕集柱，消除仪器和流动相中可能存在的本底干扰；

32.流动相：a相为超纯水，b相为甲醇，二者均为hplc级，并且均加入了体积分数0.1％的氨水作添加剂；即，a相为在超纯水中加入占超纯水体积0.1％的氨水，b相为在甲醇中加入占甲醇体积0.1％的氨水；氨水是指含氨25％～28％的水溶液；

33.流速为0.2ml min

?1；

34.流动相的洗脱梯度为：0

?

2min，40％b；2

?

3.5min，40％b

?

100％b；3.5

?

9min，维持100％b；9

?

9.1min，重新平衡至40％b；9.1

?

10min，维持40％b；

35.样品进样量为5μl；

36.质谱条件为：负电荷电喷雾离子源(esi

?

)；毛细管电压为1.47kv；源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气流量为1000l h

?1；锥气流量150l h

?1；碰撞气体为0.15ml min

?1的氩气；采用多反应监测模式(mrm)进行定量分析。

37.在本发明中：

38.1、通过优化土壤中双酚a及其13种结构类似物的萃取方法，同时综合考虑回收效率、时间、耗材及人力成本，本发明最终选择加速溶剂萃取作为同时提取14种双酚的方法；

39.2、通过优化土壤中双酚a及其13种结构类似物的净化方法，同时综合考虑回收效率、操作简便程度及吸附剂用量，本发明最终选择在线净化技术，用3g中性氧化铝作为吸附剂，作为同时净化14种双酚的方法；

40.3、通过优化液相色谱柱、柱温、流动相种类及添加剂、流动相洗脱梯度等超高效液相色谱

?

串联质谱仪的相关条件，同时综合考虑回收效率及检测时间成本，根据色谱峰保留时间、目标物的特征离子以及其丰度比进行定性，内标法定量，本发明最终仅在10min内就能很好完成14种双酚的分离。并且所有目标物具备回收率高、检出限低等特点，在该种类有机污染物的土壤介质检测领域具有重要意义。

41.与目前有机污染物的前处理和检测方法相比，本发明的优点和有益效果是：

42.14种双酚均采用加速溶剂萃取方法同时萃取，期间进行在线净化除杂，得到的提取液经减压浓缩后用甲醇定容，最后用uplc

?

ms/ms定性定量分析。根据色谱峰保留时间、目标物的特征离子以及其丰度比进行定性，内标法定量。本方法所需提取剂较少、提取和净化过程同步经dionex ase 350系统完成并节约人力、前处理操作快捷、净化效果显著、仅

10min内就能很好完成14种双酚的分离。并且各目标物具备回收率高、检出限低等特点，在该种类有机污染物的土壤介质检测领域具有重要意义。

43.综上所述，本发明通过优化样品萃取方法、萃取液净化以及超高效液相色谱

?

串联质谱的定性定量分析条件等，建立了一种能同时提取、同时净化和同时检测土壤中bpa及其13种结构类似物的方法，该方法节约时间、耗材、人力，绿色环保。

附图说明

44.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

45.图1是加速溶剂萃取过程中不同种类提取剂对14种双酚(双酚a及其十三种结构类似物)的回收影响；

46.每组中，从左至右依次为：1：乙醇；2：丙酮；3:乙酸乙酯；4：甲醇；5：甲醇/丙酮/水(45/45/10，v/v)+1％甲酸；6：甲醇/丙酮(50/50，v/v)；7：甲醇/丙酮(50/50，v/v)+1％甲酸。

47.图2是在线净化过程中不同吸附剂种类对14种双酚的回收影响；

48.每组中，从左至右依次为：

[0049][0050]

图3是在线净化过程中不同中性氧化铝含量对14种双酚的回收影响；

[0051]

每组中，从左至右依次为：2g、3g、4g、5g。

[0052]

图4是加速溶剂萃取过程中不同萃取温度对14种双酚的回收影响；

[0053]

每组中，从左至右依次为：80℃、100℃、120℃、150℃。

[0054]

图5是加速溶剂萃取过程中不同萃取循环次数对14种双酚的回收影响；

[0055]

每组中，从左至右依次为：2cycles、3cycles、4cycles、5cycles。

[0056]

图6是14种双酚的特征谱图。

具体实施方式

[0057]

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0058]

实施例1：

[0059]

一、适用范围

[0060]

本实施例中分析测试的14种双酚为：双酚a(bisphenol a，bpa)、双酚p(bisphenol p，bpp)、双酚m(bisphenol m，bpm)、双酚af(bisphenol af，bpaf)、双酚e(bisphenol e，bpe)、双酚ph(bisphenol ph，bpph)、双酚ap(bisphenol ap，bpap)、双酚f(bisphenol f，bpf)、双酚s(bisphenol s，bps)、双酚b(bisphenol b，bpb)、双酚fl(bisphenol fl，bpfl)、双酚tmc(bisphenol tmc，bp

?

tmc)、双酚bp(bisphenol bp，bpbp)、双酚z(bisphenol z，bpz)。

[0061]

二、试剂及其配制

[0062]

除非另有说明，分析时所使用的试剂均为符合国家标准的色谱级。实验用水是

mili

?

q超纯水。

[0063]

乙醇(c2h6o)：色谱纯；

[0064]

丙酮(c3h6o)：色谱纯；

[0065]

乙酸乙酯(c4h8o2)：色谱纯；

[0066]

甲醇(ch3oh)：色谱纯；

[0067]

甲醇

?

丙酮

?

水酸性混合溶剂：先将甲醇、丙酮和水按45/45/10的体积比混合，然后加入上述混合液体积1％的甲酸作为添加剂；

[0068]

甲醇

?

丙酮混合溶剂：甲醇和丙酮按1/1的体积比混合；

[0069]

甲醇

?

丙酮酸性混合溶剂：甲醇和丙酮按1/1的体积比混合，然后加入上述混合液体积1％的甲酸作为添加剂；

[0070]

吸附剂硅胶、酸性/中性氧化铝、florisil，加速溶剂萃取池填料硅藻土和石英砂均在马弗炉中于450℃高温灼烧10h，冷却至室温后备用。

[0071]

双酚标准储备液：100μg ml

?1(每种双酚)，溶于甲醇，

?

20℃保存。

[0072]

双酚标准中间溶液：准确移取适量体积的混合标准储备溶液，用甲醇稀释至所需浓度，

?

20℃保存。

[0073]

进样内标使用溶液：双酚a

?

d6(bpa

?

d6)，100μg ml

?1，溶于甲醇，

?

20℃保存。

[0074]

进样内标中间溶液：准确移取适量体积的进样内标使用溶液，用甲醇稀释至所需浓度，

?

20℃保存。

[0075]

待测目标双酚混合标准工作溶液：因为在实验中发现明显的土壤基质效应，抑制了目标物质的相应强度，故使用基质标线来对样品进行处理。按样品前处理方式对空白土壤进行前处理后得到1ml浓缩液，为基质提取液；

[0076]

准确称取适量的双酚标准中间溶液以及进样内标中间溶液溶于1ml的基质提取液中制备成含14种双酚混合浓度为1ng ml

?1、5ng ml

?1、10ng ml

?1、50ng ml

?1、100ng ml

?1、200ng ml

?1和含进样内标物浓度为50ng ml

?1的混合标准工作溶液，

?

20℃保存。

[0077]

三、仪器及设备

[0078]

超高效液相色谱

?

三重四级杆质谱仪(waters acquity uplc i

?

class/xevo tq

?

xs)；acquity beh phenyl色谱柱(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；acquity beh c18色谱柱(2.1mm

×

50mm，1.7μm)；acquity beh c18色谱柱(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；cortecs c18+色谱柱(2.1mm

×

100mm，1.6μm)；加速溶剂萃取仪(dionex ase 350)；heidolph旋转蒸发器；数显恒温水浴锅；mx

?

s涡旋混匀仪；立式冷冻干燥机；马弗炉；thermo超速离心机；一般实验室常用仪器和设备。

[0079]

四、所述超高效液相色谱

?

串联质谱法同时测定土壤中14种双酚的方法包括如下步骤：

[0080]

1、样品制备

[0081]

采集的土壤样品置于棕色玻璃瓶中，玻璃瓶先用超纯水洗净，于马弗炉中450℃灼烧10h以彻底去除玻璃瓶内残留的有机物等；采集后的土壤样品于4℃以下冷藏、避光、密封保存，尽快带到实验室分析。

[0082]

将土壤样品放在搪瓷盘上，混匀，除去枝棒、叶片、石子等异物，放于真空冷冻干燥机中干燥脱水(0.2mbar的真空度、

?

50℃，干燥5d，此时样品的至含水率小于1％)；干燥后的

土壤过2mm筛，然后用研钵和研棒研磨至过100目筛的均匀粉末，置于琥珀色玻璃小瓶中保存在4℃条件下备用。

[0083]

2、样品前处理

[0084]

因为常用的提取方法后需要经固相萃取柱进行净化除杂，该过程通常耗时耗力。因此在实验室现有条件下，本发明考虑使用加速溶剂萃取结合在线净化技术对样品进行前处理操作。

[0085]

具体步骤为：在34ml的不锈钢萃取池底部垫入cellulose ase萃取膜，从底部向上依次填入2g硅藻土，3g中性氧化铝，空白土壤和硅藻土等质量比的混合物，用量2g(防止土壤板结)，加入混合标样(100ng g

?1)和氘代内标(100ng g

?1)，最后用石英砂铺满萃取池。因此，在萃取池中的填料为层层分明。

[0086]

用甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸作为加速溶剂萃取的提取剂，每个萃取池需要提取剂的量约为65ml；萃取过程(ase)在以下条件下运行：每个循环为：100℃，1500psi平衡压力，加热时间5min，静态提取时间5min；3个循环，漂洗量60％和吹扫时间100s。

[0087]

收集提取液，而后在50℃水浴下减压蒸发浓缩至约0.5ml，用甲醇定容至1ml，作为浓缩液；

[0088]

将浓缩液转移至2ml离心管中，放入thermo超速离心管中，在2500g速度下离心10min，取上清液放入waters自动进样器样品瓶中，以待后续分析。

[0089]

说明：空白土壤是指选用的几乎没有受过农膜覆盖、农药喷洒等污染的土壤样品。

[0090]

3、样品测定

[0091]

(1)色谱条件为：

[0092]

色谱柱：acquity beh phenyl(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；柱温40℃；样品进样量为5μl；

[0093]

在二元溶剂管理器前，使用较短的uplc色谱柱(acquity beh c18，2.1mm

×

50mm，1.7μm)作为捕集柱，捕集柱的作用是把流动相中的可能含有的双酚给捕集掉，从而消除仪器和流动相中可能存在的本底干扰；

[0094]

流动相：a相为超纯水，b相为甲醇，二者均为hplc级，并且均加入了体积分数0.1％的氨水作添加剂；流速为0.2ml min

?1；

[0095]

流动相的洗脱梯度为：0

?

2min，40％b；2

?

3.5min，40％b

?

100％b；3.5

?

9min，维持100％b；9

?

9.1min，重新平衡至40％b；9.1

?

10min，维持40％b；

[0096]

(2)质谱条件为：负电荷电喷雾离子源(esi

?

)；毛细管电压为1.47kv；源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气流量为1000l h

?1；锥气流量150l h

?1；碰撞气体为0.15ml min

?1的氩气；采用多反应监测模式(mrm)进行定量分析。14种双酚物质的定量标准曲线相关线性系数r2为0.9938～0.9998。

[0097]

五、记录与计算

[0098]

1、14种双酚的定性分析

[0099]

使用mrm模式(表1)。图6为14种双酚的特征离子谱图。

[0100]

表1不同双酚的母离子、定量/定性特征离子、锥孔电压、碰撞能及保留时间

[0101][0102][0103]

2、14种双酚的定量分析

[0104]

绘制标准曲线：因为在实验中发现明显的土壤基质效应，抑制了目标物质的相应强度，故使用基质标线来对样品进行处理。按样品前处理方式对空白土壤进行前处理后得到1ml浓缩液，为基质提取液；

[0105]

准确称取适量的双酚标准中间溶液以及进样内标中间溶液溶于1ml的基质提取液中制备成含14种双酚混合浓度为1ng ml

?1、5ng ml

?1、10ng ml

?1、50ng ml

?1、100ng ml

?1、200ng ml

?1和含进样内标物浓度为50ng ml

?1的6种双酚浓度梯度混合标准工作溶液(其中进样内标浓度恒定)，

?

20℃保存。相关系数要达到0.99以上。

[0106]

样品测定：用以上6种双酚浓度梯度混合标准工作溶液(其中进样内标浓度恒定)

绘制标准曲线，该曲线的纵坐标为目标组分定量离子峰面积a

x

与进样内标的定量离子峰面积a

is

之比。横坐标为目标组分的浓度c

x

与进样内标的浓度c

is

之比。由此求得相应因子rf。

[0107][0108]

实际土壤样品中在测定前加入相同浓度的进样内标，测得目标物的定量离子峰面积a

x

后，分别计算土壤样品中各目标物的质量浓度，计算公式如下：

[0109][0110]

式中：c

x

—实际土壤样品中目标物含量，mg kg

?1；

[0111]

a

x

—目标物定量离子峰面积；

[0112]

q

is

—进样内标量，μg；

[0113]

a

is

—进样内标定量离子峰面积；

[0114]

rf—相应因子；

[0115]

m—土壤样品的称取量，g；

[0116]

100％—样品干物质量，％；

[0117]

六、方法学验证

[0118]

1、标准曲线、检出限和定量限

[0119]

分别配制1ng ml

?1、5ng ml

?1、10ng ml

?1、50ng ml

?1、100ng ml

?1、200ng ml

?1的浓度梯度的14种双酚的标准混合样品溶液(样品中，内标的浓度为50ng ml

?1)，按照uplc

?

ms/ms条件，从低浓度到高浓度依次进样分析。以目标组分的浓度与进样内标的浓度比为横坐标，以目标组分定量离子峰面积与进样内标的定量离子峰面积比作为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示：14种双酚化合物的相关系数均大于0.9938(0.9938～0.9998)，线性关系良好；

[0120]

方法开发的土壤本底值经测定很低，几乎可以忽略。在土壤中加入14种双酚以及内标的混合标准中间样，配制成20ng g

?1的标准样品(内标浓度为100ng g

?1)；

[0121]

按照上述步骤四、步骤五进行检测，连续分析7次上述低浓度的土壤空白加标样品，计算标准偏差s。仪器检出限(instrument detection limit，idl)定义为信噪比增加3倍时的浓度，方法检出限(method detection limit，mdl)根据美国epasw

?

846中规定方法mdl＝s*t(n

?

1,0.99)计算方法检出限，其中公式中t(n

?

1,0.99)指置信度为99％、自由度为n

?

1时的t值，此处为3.143；n为平行分析样品数，此处为7。方法定量(method quantification limit，mql)限规定为标准偏差s的10倍。具体结果见表2，双酚的检出限范围为1.25

?

3.41ng g

?1，定量下限在3.99

?

10.85ng g

?1之间。

[0122]

表2不同双酚的标准曲线方程、相关系数、检出限及定量限(n＝7)

[0123][0124][0125]

2、精密度与准确度

[0126]

土壤采自浙江省杭州市，采集的土壤样品与冰袋一同置于保温箱中运回实验室，如上述步骤四.1所述，除去土壤中植物组织及石块等异物，将土样混合均匀，干燥，然后用研钵和研棒研磨至过100目筛的均匀粉末，置于琥珀色玻璃小瓶中保存在4℃条件下备用。

[0127]

土壤基本理化性质依据《土壤农化分析》进行分析：土壤机械组成为砂粒、粉粒和黏粒，质量分数分别为63.0％、26.5％和10.5％，有机质含量为13.30g kg

?1，总氮含量为1.08g kg

?1，总磷含量为1.74g kg

?1，ph为5.80；不含表1所述的14种双酚。

[0128]

分别向1g洁净土样中加入适量的14种双酚以及内标物质，进行加标回收率测定(即，按照上述步骤四的2～3、步骤五进行检测)。加标浓度梯度分别为20、100、200ng g

?1，内标浓度为100ng g

?1，每个浓度水平做3次平行。

[0129]

以上3个浓度梯度土壤加标回收试验中，双酚的回收率范围分别为80.33％

?

118.67％、79.53％

?

114.27％和80.20％

?

115.80％；标准偏差范围分别为3.46％

?

8.72％、0.20％

?

5.98％、0.31％

?

4.61％。详见表3。

[0130]

表3低中高三个浓度下不同双酚的回收率及标准偏差(n＝3)

[0131][0132][0133]

3、方法重复性

[0134]

此外，对上述三个浓度进行了日内和日间重复实验，比较了日内和日间的差异，评估方法的重复性。日内实验为在一天中早中晚三个时间段对上述三个浓度的样品进行分析，日间实验是在第1、3、7三天的同一时间段进行三个浓度的分析比较；

[0135]

如表4所示，日内回收率标准偏差小于10％，日间小于11％，显示出优异的可重复性。

[0136]

表4低中高三个浓度下不同双酚回收率的日内和日间差异(n＝3)

[0137][0138][0139]

因此，该发明能实现对土壤中双酚a及其13种结构类似物的同时萃取、同时净化、同时检测分析。并且本方法所需提取溶剂少、前处理操作快捷、净化效果显著、仅在10min内就能很好完成14种物质的分离并且各目标物具备回收率高、检出限低等特点，节约了时间和经济成本，在该种类有机污染物的土壤介质检测领域具有重要意义。

[0140]

对比例1、将实施例1样品前处理中的加速溶剂由“甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸”分别改成“乙醇”、“丙酮”、“乙酸乙酯”、“甲醇”、“甲醇/丙酮/水(45/45/10，v/v)+1％甲酸”、“甲醇/丙酮(1/1，v/v)”，其余等同于实施例1。

[0141]

所得结果如图1所述：不同提取剂对双酚回收率影响显著。对于bps，只有提取剂为甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸时，才能满足回收率在80％

?

120％的标准。并且该提取剂对于其他13种双酚的回收率均能满足该标准。对于其余6种提取剂，均存在回收率偏低(小于80％)或偏高(大于120％)的情况，因此选择甲醇/丙酮(1/1,v/v)+1％甲酸作为ase过程的提取剂。

[0142]

对比例2、将实施例1样品前处理中的作为吸附剂的“中性氧化铝”改成“酸性氧化铝”、“硅胶”、“florisil”、“c18”，其余等同于实施例1。

[0143]

所得结果如图2所述：当酸性氧化铝作吸附剂时，14种双酚的回收率范围为81％

?

149％(其中bpaf为149％)；中性氧化铝作吸附剂时，回收率在83％

?

115％；硅胶作吸附剂时，回收率在76％

?

116％(其中bpz,bpfl,bpph回收率为76％)；florisil作吸附剂时，回收率为43％

?

166％(其中bpph为43％，bpaf为132％，bpz为74％，bps为166％)；c18作吸附剂时，回收率为70％

?

147％(其中bpph为70％,bpaf为140％,bps为147％)。因此可得只有中性氧化铝作吸附剂时，可以满足所有双酚的回收率均符合80％

?

120％的标准。萃取池中填充的吸附剂用于吸附土壤中除目标分析物之外的其他杂质，适量的吸附剂需要满足尽可能吸附杂质的同时又不吸附目标物质，使得目标物有较高的回收率。因此，选择中性氧化铝作为在线净化的吸附剂。

[0144]

对比例3、将实施例1样品前处理中的作为吸附剂的“3g中性氧化铝”改成“2g”、“4g”、“5g”，其余等同于实施例1。

[0145]

所得结果如图3所述：比较了不同量的中性氧化铝作吸附剂时，各双酚的回收率情况，发现吸附剂的含量对双酚回收率的影响不显著，所有情况下均满足了回收率在80％

?

120％的标准，且差别不大。当吸附剂量为3g时，13种物质(除了bpf)的回收率较2g吸附剂时有增大；吸附剂量为4g时，较3g的情况，8种物质(bpe，bpb，bps，bpz，bp

?

tmc，bpm，bpp，bpph)的回收率降低了；量为5g时，11种物质(bpa，bpb，bps，bpz，bpap，bp

?

tmc，bpaf，bpm，bpp，bpbp，bpph)的回收率有所降低。结合绿色化学理念，使用3g的中性氧化铝既能确保最好的回收率情况，又节约耗材，产生更少的实验有机废物。因此选择3g的中性氧化铝作为在线净化的吸附剂。

[0146]

对比例4、将实施例1样品前处理中的加速溶剂萃取温度由100℃改成80℃、120℃、150℃，其余等同于实施例1。

[0147]

所得结果如图4所述，除了bpf，bpe，bpfl三种物质外，100℃下的目标物质的回收率均优于80℃下的；而当温度升高时，除了bpf，bpe，bpp的回收率略有升高外，其余11种物质的回收率反而降低了；当温度达到150℃时，绝大多数物质的回收率有了较明显的降低(bpf，bpe，bpa除外)，特别的，bps的回收率只有55％，bpaf只有76％，bpph只有67％，均低于标准的80％。综上，100℃是双酚ase的最适温度，回收率最优化的同时能节约萃取的时间。故选择100℃作为ase的提取温度。

[0148]

对比例5、将实施例1样品前处理中的加速溶剂萃取循环次数由3次改成2次、4次、5次，其余等同于实施例1。

[0149]

所得结果如图5所述，比较了不同的提取循环次数对最终双酚的回收率的影响，一般来说，ase萃取的循环次数越多，物质的回收率越高。本实验中的结果也基本满足这一规律。循环次数为3时，较次数为2时，有13种物质的回收率增高(bpa除外)，但是当循环提取4次时，bpm和bpfl的回收率略超出了标准值120％，分别达到了124％和131％。次数进一步增加到5次时，有7种物质的回收率高于标准值(bps为121％，bpap为125％，bpaf为131％，bpm为126％，bpp为127％，bpfl为140％，bpbp为127％)。因此，认为循环次数为3次是最优的。

[0150]

实验1、取消“2、样品前处理”中的“加入混合标样(100ng g

?1)”，其余等同于实施例1。

[0151]

将实际待测的以下土壤样品(从污染严重地取样所得)按照上述方法进行检测，所得结果如表5所示。

[0152]

表5实际土样中双酚污染情况(ng g

?1d.w.)

[0153][0154]

nd：未检测到；

a

：低于方法定量限。

[0155]

与目前已有的环境固体介质中双酚分析方法进行比较(表6)，可见本发明中提到的方法具有更低的方法检出限、方法定量限，以及更高的回收率，具有更好的灵敏度、精密度和可重复性。

[0156]

表6现有方法与本发明方法的性能比较

[0157][0158]

a

：未提及。

[0159]

[1]y.yang,l.lu,j.zhang,y.yang,y.wu,b.shao,simultaneous determination of seven bisphenols in environmental water and solid samples by liquid chromatography

?

electrospray tandem mass spectrometry,j chromatogr a 1328(2014)26

?

34.

[0160]

[2]z.huang,j.l.zhao,y.y.yang,y.w.jia,q.q.zhang,c.e.chen,y.s.liu,b.yang,l.xie,g.g.ying,occurrence,mass loads and risks of bisphenol analogues in the pearl river delta region,south china:urban rainfall runoff as a potential source for receiving rivers,environ pollut 263(pt b)(2020)114361.

[0161]

[3]x.yu,j.xue,h.yao,q.wu,a.k.venkatesan,r.u.halden,k.kannan,occurrence and estrogenic potency of eight bisphenol analogs in sewage sludge from the u.s.epa targeted national sewage sludge survey,j hazard mater 299(2015)733

?

9.

[0162]

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。技术特征：

1.土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法，其特征包括如下步骤：(1)样品制备：将土壤样品除杂混匀后进行干燥脱水，过筛，备用；(2)样品提取及净化：2.1)、称取1克步骤(1)所得的土壤进行加速溶剂萃取，净化，得到提取液；2.2)、将提取液浓缩至0.5

±

0.1ml，并用甲醇定容至1

±

0.1ml，得浓缩液；2.3)、对浓缩液进行离心除杂，收集上清液；(3)样品检测：将上清液中的土壤中双酚a及其十三种结构类似物用超高效液相色谱

?

串联质谱法进行定性定量分析。2.根据权利要求1所述的土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法，其特征是：所述步骤2.1)中：加速溶剂萃取过程中使用萃取池，在其底部垫入cellulose ase萃取膜，从底部向上依次填入2g硅藻土，3g中性氧化铝，空白土壤和硅藻土等质量比的混合物2g，加入混合标样(100ng g

?1)和氘代内标(100ng g

?1)，最后用石英砂铺满萃取池；用甲醇

?

丙酮酸性混合溶剂作提取剂，萃取过程在以下条件下运行：80

?

150℃，1500psi平衡压力，加热时间5

?

7min，静态提取时间5min，2

?

5个循环，漂洗量60％和吹扫时间100s；甲醇

?

丙酮酸性混合溶剂为甲醇和丙酮按1/1的体积比混合，然后加入上述混合液体积1％的甲酸作为添加剂。3.根据权利要求2所述的土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法，其特征是：所述步骤2.2)中，浓缩方法为减压旋蒸浓缩，将加速溶剂萃取后收集到的提取液在heidolph旋转蒸发器中55℃的水浴中减压旋蒸浓缩至0.5

±

0.1ml，然后用甲醇定容至1

±

0.1ml。4.根据权利要求3所述的土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法，其特征是：所述步骤2.3)中，将浓缩液倒入2ml离心管中，在超速离心机中以2500g的速度离心10min后，取上清液。5.根据权利要求1～4任一所述的土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法，其特征是：液相色谱的条件为：液相色谱柱：acquity beh phenyl；柱温40℃；流动相：a相为在超纯水中加入占超纯水体积0.1％的氨水，b相为在甲醇中加入占甲醇体积0.1％的氨水；流速为0.2ml min

?1；流动相的洗脱梯度为：0

?

2min，40％b；2

?

3.5min，40％b

?

100％b；3.5

?

9min，维持100％b；9

?

9.1min，重新平衡至40％b；9.1

?

10min，维持40％b；样品进样量为5μl；质谱条件为：负电荷电喷雾离子源；毛细管电压为1.47kv；源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气流量为1000l h

?1；锥气流量150l h

?1；碰撞气体为0.15ml min

?1的氩气；采用多反应监测模式进行定量分析。

6.根据权利要求1～5任一所述的土壤中双酚a及其十三种结构类似物的同步测定方法，其特征是：所述步骤(1)中的干燥为冷冻干燥。

技术总结

本发明公开了一种土壤中双酚A及其十三种结构类似物的同步测定方法，包括如下步骤：将土壤样品除杂混匀后进行干燥脱水，过筛，备用；样品提取及净化，收集上清液；将上清液中的土壤中双酚A及其十三种结构类似物用超高效液相色谱

技术研发人员：吕志江 徐逸文 何艳 徐建明

受保护的技术使用者：浙江大学

技术研发日：2020.12.16

技术公布日：2021/4/26