本发明公开了一种单克隆抗体蛋白细胞培养液澄清的预处理方法，属于蛋白质纯化制备领域。
背景技术：
单克隆抗体(monoclonalantibody,mab)是一类重要的生物技术药物，在现代生物检测领域和医疗领域起着越来越重要的作用。现有技术中，单克隆抗体通常由中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovary，cho)表达产生，随着上游高表达细胞株的构建、基因改造、发酵条件的不断优化，cho细胞的单克隆抗体表达量已经达到30g/l以上，培养规模也逐步扩大，伴随着生物量以及杂质量的显著提高，上游产能的提升给下游分离纯化过程带来极大的压力。而高效的细胞回收液澄清预处理将大大减轻后续抗体纯化的压力，对于缩短工艺流程、提高经济性具有决定性的作用。由此可见，评价细胞回收液澄清效果的主要标准已经逐渐转变为不单单能有效地去除哺乳动物细胞、细胞碎片，更重要是在保证最终抗体蛋白回收率的同时，尽可能多地去除宿主细胞蛋白(hostcellprotein,hcp)、宿主残留dna、高分子量蛋白聚集体等污染物。
传统单克隆抗体分离纯化通常包括蛋白a亲和层析纯化、阴阳离子交换树脂纯化、疏水性作用树脂纯化等3-4步单元操作，工艺流程长、产品产率较低，导致单克隆抗体产品成本居高不下。因此如何缩短工艺流程、降低生产成本直接决定了在当前上游产能大大提升状况下，下游抗体分离纯化的主要研究方向。离心和切向流过滤常被应用于工业中去除细胞，最近几年深层过滤的应用也越来越广泛。絮凝剂用来增强细胞、杂质的去除和离心的效果也越来越受到广泛的关注。沉淀法因具有操作简单、省时省力、回收率高等特点在抗体分离纯化中应用广泛。沉淀技术的原理是利用不同蛋白疏水性的差异，通过调节盐浓度沉淀相应的蛋白，达到分离纯化的目的。辛酸是一种饱和脂肪酸，促进酸性蛋白发生沉淀，等电点较高的单克隆抗体因具有足够的电荷以中和辛酸的疏水作用，得以保留在上清液中，但是该方法会增加浊度和黏度，不利于分离上清液。所以本领域亟需一种更为简单有效的沉淀法用于单克隆抗体细胞培养液的澄清以增加后续分离纯化的效率。因此，本发明的目的就是提供一种操作便捷、快速高效地基于脂肪酸沉淀的单克隆抗体细胞培养液澄清的预处理方法。
技术实现要素：
为实现上述发明目的，本发明提供了一种使细胞培养液澄清的预处理方法，以去除各种宿主细胞杂质，所述方法包括以下步骤：
(1)在所述细胞培养回收液中添加9或10碳脂肪酸；
(2)调节并保持ph为5.0-5.5的反应环境使脂肪酸与培养液反应；反应进行20-40分钟后加入精胺，所述精胺在酸性条件下呈现多阳离子多胺类特性，与dna结合以辅助并促进抗体污染物的进一步凝聚；
(3)降低反应温度至25℃以下并静置，以使脂肪酸呈固态析出；
(4)去除步骤(3)析出的固态杂质，收集上清液。
在一个优选的技术方案中，所述脂肪酸为十碳脂肪酸，即癸酸。
在一个更为优选的技术方案中，所述培养液为cho细胞发酵获得的培养液。
更为优选地，在步骤(1)中，在细胞发酵结束前2-4小时至发酵结束后添加所述癸酸进入细胞培养液。
再为优选地，步骤(1)中，所述癸酸的终浓度为0.2-1％。
尤为优选地，步骤(1)中，所述癸酸的终浓度为0.4％。
在另一个优选的技术方案中，步骤(2)中，所述精胺的终浓度保持在0.1％。
在一个优选的技术方案中，步骤(2)中，所述反应的温度为35-37℃。
在另一个优选的技术方案中，步骤(2)中，所述反应的时间为2-4小时。
在另一个优选的技术方案中，步骤(3)中，所述静置的时间为2-4小时。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)操作简单、耗时短、工作量小，可应用于工业化生产。
2)操作温度易控，符合常规工业生产设备要求。
3)应用该方法纯化的单克隆抗体的纯度和收率高，hcp降低至低于500ppm，dna小于10ppb；igg1纯度为95％以上，回收率高于90％。当应用赛多利斯双级深层过滤时，利用癸酸沉淀后的细胞回收液滤过量是利用辛酸沉淀的两倍以上。
附图说明
图1：利用癸酸沉淀分离纯化单克隆抗体的流程图一；
图2：癸酸浓度与igg收率相关性曲线图；
图3：利用癸酸沉淀分离纯化单克隆抗体的流程图二
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明，但以下实施例仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明，所有化学试剂均为商用常规分析纯试剂。
癸酸，又名正癸酸、羊蜡酸(capricacid；decanoicacid；decatoicacid；decylicacid；decoicacid；nonane-d-carboxylicacid)，分子式：ch3(ch2)8co(oh)，分子量：172.27，cas号：334-48-5
其分子式如下式(i)所示：
癸酸主要用于制取癸酸酯类产品，其酯类用作香料、湿润剂、增塑剂和食品添加剂等。
精胺，是含有两个氨基和两个亚氨基的多胺类物质(中文别名：精碱精素；精胺；精素；n,n'-双(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺；o,o-二甲基硫代磷酰胺；1,12-二氨基-4,9-二氮十二烷)，分子量：202.34，cas号：71-44-3。
其分子式如下式(ii)所示：
精胺可作为有机磷农药中间体。同时，精胺是典型的阴离子表面活性剂，具有良好的渗透、乳化、泡沫和去污能力，广泛应用于化工，农药、纤维、电渡、选矿等工业，尤其适用于化妆品、牙膏、香波等的制造。纺织工业中适用于洗涤羊毛和丝绸。
实施例1.单克隆抗体细胞培养液的澄清(具体流程见图1)
(1)细胞培养：单克隆抗体igg1由cho表达产生，抗体在5l
b搅拌式玻璃生物反应器中生产，采用分批补料的培养方式，利用1∶1的无蛋白培养基cdcho(lifetechnologies)和hyqpf(gehealthcare)。
(2)培养液预处理：将细胞培养液在室温、4000×g条件下离心20min，之后经由0.22μm滤膜(
rapid-flowfilters,thermoscientific)过滤，收集过滤液。
(3)沉淀污染物：在收集的过滤液中添加癸酸，使其终浓度为0.4％，通过添加1m醋酸或1mtris缓冲液将反应ph调至5.0-5.5，在反应进行30分钟后加入终浓度为0.1％的精胺。37℃混匀4h，搅拌速率控制在200-300rpm。之后将温度降至25℃。
(4)分离污染物沉淀：4000g离心15min，收集上清液。
(5)检测：通过generationiiichohcp试剂盒检测，hcp降低至500ppm以下；由数字型pcr仪qx100tmdropletdigitaltmpcrsystem(bio-rad)测量dna小于10ppb；igg1纯度为高于95％，回收率高于90％。
实施例2.不同癸酸浓度对宿主杂质去除的影响
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)培养液预处理：同实施例1。
(3)沉淀污染物：在收集的过滤液中添加不同量的癸酸，使其终浓度分别为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％，ph调至5.0-5.5，37℃混匀4h。将温度降至25℃，静置4h。
(4)分离污染物沉淀：同实施例1。
(5)检测：同实施例1。结果显示，综合考虑抗体蛋白收率与宿主杂质去除效率，0.4％的癸酸浓度为最优(见图2)。
实施例3.单克隆抗体细胞培养液的澄清(具体流程见图3)
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)检测：同实施例1。hcp降低至低于500ppm，dna小于10ppb；igg1纯度为95％以上，回收率高于90％。
实施例4.辛酸和癸酸细胞培养液澄清对比
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加辛酸和癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)应用赛多利斯双级深层过滤，利用癸酸沉淀后的细胞回收液滤过量是利用辛酸沉淀的两倍以上。
实施例5.应用蛋白a亲和层析分离癸酸澄清后细胞培养液
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)经过蛋白a分离纯化单克隆抗体hcp降低至低于检测线，dna小于1ppb；igg1纯度为99％以上，回收率高于99％。而没有经过癸酸澄清的细胞回收液，hcp在500-1000ppm，dna小于1ppm；igg纯度为95％，回收率为90-95％。
实施例6.应用切向流过滤分离纯化癸酸法澄清后的细胞培养液
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)直接应用切向流过滤浓缩进行单克隆抗体的分离纯化，hcp降低至低于100ppm，dna小于10ppb；igg1纯度为95％以上，回收率高于95％。符合现有fda标准的单克隆抗体蛋白产品。实现无色谱柱单克隆抗体分离纯化。
技术特征：
技术总结
本发明公开了一种基于9?10碳脂肪酸单克隆抗体细胞培养液澄清的方法。所述方法是在发酵后期或发酵完成后在培养液中加入所述脂肪酸，溶液pH调至5.0?5.5，通过搅拌，在37℃呈液态的脂肪酸特异性吸附宿主蛋白、残留DNA、抗体聚集体等污染物，反应20?40分钟后加入精胺，利用其在酸性条件下呈现多阳离子多胺类特性，与DNA结合以促进污染物的进一步凝聚；当温度降至25℃以下，所述脂肪酸呈固态析出，通过离心或过滤去除固态沉淀，即可达到细胞培养液澄清的预处理目的。本发明操作简单、耗时短、温度易控，极大减轻了后续蛋白纯化的压力，缩短了工艺流程，既可用于实验室小体系制备，又可用于产业化生产。
技术研发人员：宋海鹏
受保护的技术使用者：深圳市国创纳米抗体技术有限公司
技术研发日：2017.05.01
技术公布日：2017.07.11 专利名称：一种
浮选菱镁矿矿石的药剂制度的制作方法
技术领域：
本发明是利用浮选工艺方法提纯菱镁矿矿石的一种药剂制度。
目前为得到质量较高的菱镁矿精矿，包括高纯的菱镁矿精矿，常采用浮选法脱除菱镁矿矿石中伴生的含钙、硅和铁的有害杂质矿物，如白云石、方解石、各种硅酸盐和石英。通常采用的浮选工艺是首先以脂肪胺或芳香胺化合物作为扑收剂，用反浮选法除去菱镁矿矿石中伴生的石英和部分硅酸盐矿物，然后再以脂肪酸类化合物作为扑收剂，配合使用各种抑制剂用正浮选法除去白云石、方解石和部分硅酸盐矿物。当以上述胺类化合物作为扑收剂，利用反浮选法提纯菱镁矿矿石时，胺类扑收剂对菱镁矿和白云石、方解石及部分硅酸盐的作用均较弱，有用矿物菱镁矿和有害杂质矿物的可浮性之间的差异小，因而不能有效的脱除菱镁矿矿石中的杂质矿物，还往往提高了菱镁矿和粗精矿中的钙含量，並且对一些硅酸盐的扑收作用也不太好。另外使用上述工艺及药剂制度时，工艺较复杂;药剂种类较多。正浮选时需将矿浆加温，为生产操作和管理带来不便，由于工艺和药剂制度较复杂，为菱镁矿浮选厂的回水综合利用带来困难。
为解决上述问题本发明提出了一种加调整剂的药剂制度。在反浮选过程中加入适量的无机磷酸盐(包括各种正磷酸盐、偏磷酸盐、聚磷酸盐和焦磷酸盐)，提高了胺类化合物对白云石、方解石和硅酸盐类矿物的扑收能力，而菱镁矿的可浮性同未加无机磷酸盐时的可浮性基本相同。从而增强了反浮选过程脱去含钙、硅和铁的有害杂质矿物的作用。本发明的药剂制度只需反浮选工艺即可达到目前通常采用的反浮选-正浮选联合工艺才能达到的选别技术指标(精矿品位和有用矿物回收率)。
本发明的具体内容叙述如下在使用脂肪胺和芳香胺化合物作为扑收剂，利用反浮选工艺方法除去菱镁矿矿石中的杂质时，加入适量的无机磷酸盐(包括正磷酸盐、偏磷酸盐、聚磷酸盐和焦磷酸盐)作为调整剂。为获得最佳的选别技术经济指标，使用本发明的药剂制度时需根据待选别的菱镁矿矿石性质来确定使用的各种药剂的合适用量和最佳PH值范围，处理菱镁矿原矿时，扑收剂胺类化合物的用量通常为50g/T～300g/T，无机磷酸盐的用量通常为50g/T～500g/T，介质PH值范围可在3～10之间。无机磷酸盐可加入到调浆槽里，也可加在磨机或
浮选机中，通过加入调整剂增强了胺类扑收剂对白云石、方解石和一些硅酸盐杂质矿物的扑收作用;改善了分选效果;提高了利用浮选法提纯菱镁矿矿石的技术经济指标。
采用本发明药剂制度的工艺同传统的菱镁矿浮选工艺相比较，具有以下优越性1.可减少60%的浮选机，降低了菱镁矿浮选厂的基建投资。
2.可减少
浮选药剂的数量和种类，降低能耗和减少现场管理人员，可使生产每吨菱镁矿精矿的成本降低50%～60%。
3.可增加反浮选泡沫产品的流动性，使其便于处理和输送。
4.工艺简化后可提高选矿厂回水综合利用水平。
下面通过实施例对本发明进行具体说明用本发明药剂制度，采用反浮选小型试验工艺对一级菱镁矿粉矿进行选别试验。具体实验条件是经盐酸中和后的十二胺用量150g/T，六聚偏磷酸钠用量200g/T(或磷酸二氢钠250g/T，或焦磷酸钠250g/T)。用工业盐酸调整介质PH值到4～6。加药顺序如下盐酸，无机磷酸盐，十二胺。首先选别4.0分钟，得到产率为25%～28%的最终
尾矿，然后再浮选3.5分钟即可得到产率为40%～45%的最终精矿和产率为27%～35%的中矿，原矿和各种产品的技术指标见下表种类产率烧碱 Sio2Al2O3Fe2O3CaO MgO MgO%(镁砂中)精石46.2151.550.040.010.310.5147.5398.20中矿25.9151.400.150.060.400.6047.3097.50尾矿27.8849.712.160.790.801.0045.2790.50原矿10050.000.660.230.470.6746.8495.8权利要求
1.一种利用浮选工艺方法提纯菱镁矿矿石的药剂制度，本发明的特征是当用胺类化合物作为扑收剂时，加入无机磷酸盐作为调整剂，在适当的介质PH值范围内，用反浮选工艺提纯菱镁矿矿石。
2.根据权利要求1中所述的无机磷酸盐包括各种正磷酸盐、偏磷酸盐、聚磷酸盐和焦磷酸盐。
3.根据权利要求1中所述的适当介质PH值范围根据待选的菱镁矿矿石性质而定，介质PH值可在3～10范围内变化。
全文摘要
本发明是利用浮选工艺方法提纯菱镁矿矿石的一种药剂制度。其特点是使用胺类扑收剂通过反浮选工艺脱除菱镁矿杂质时，加入适量的无机磷酸盐，改善分选效果。这样对菱镁矿矿石只进行一次反浮选处理即可达到目前用反浮选—正浮选联合工艺处理方可达到的技术指标。简化了目前菱镁矿矿石浮选工艺流程。减少了浮选药剂的种类、数量、设备投资和管理费用。使生产成本降低50％～60％。有利于反浮选泡沫产品的输送和提高菱镁矿浮选厂的回水利用率。
文档编号B03D1/00GK1037098SQ89104249
公开日1989年11月15日 申请日期1989年6月24日 优先权日1989年6月24日
发明者李晓安, 董淑缓, 王义强 申请人:鞍山钢铁学院
声明：
“浮选菱镁矿矿石的药剂制度的制作方法” 该技术专利(论文)所有权利归属于技术(论文)所有人。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系该技术所有人。
我是此专利(论文)的发明人(作者)
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编辑：中冶有色技术网
来源：鞍山钢铁学院
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2024年08月01日 ~ 03日 
