海洋菌浸出低品位硫化矿的方法

权利要求

1.海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，其特征在于，所述海洋菌浸出低品位硫化矿的方法利用一株在海陆交界处采集的一株氧化亚铁杆菌，通过连续培养后，在pH＝1.8，生长温度T＝30℃的情况下，连续浸矿28天后，浸出黄铜矿和闪锌矿。

2.如权利要求1所述的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，其特征在于，所述海洋菌浸出低品位硫化矿的方法包括：

调节9K基础培养基的pH为1.8，取100ml该培养基于锥形瓶中，于高压灭菌锅中121℃灭菌20min，趁热取15ml培养液将4.47gFeSO4·7H2O溶解后，加入1.0g/L矿样；用0.02mm滤膜将FeSO4溶液全部过滤到锥形瓶中；待锥形瓶内液体凉至室温，用移液枪取10ml氧化亚铁菌液于锥形瓶中；将锥形瓶置于30℃恒温摇床中，在160r转速下培养28h；然后置于4℃恒温冰箱中，冷藏保存待用；所述氧化亚铁菌液中的细菌浓度为1×106cell/ml。

3.如权利要求2所述的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，其特征在于，所述海洋菌浸出低品位硫化矿的方法具体包括：

步骤一，培养细菌：调节基础培养基的pH，高压灭菌，趁热取FeSO4·7H2O溶解后，用滤膜将FeSO4溶液全部过滤；置于恒温摇床中，培养28h；然后置于恒温冰箱中，冷藏保存待用；

步骤二，细菌镜检：将步骤一中得到的菌液，取上清液，过滤后，离心，底部得到白色沉淀物氧化亚铁菌，弃去上清液，用无菌水清洗，收集到无菌离心管中备用；

步骤三，绘制生长曲线：进行细菌计数，采用显微镜计数法；

步骤四，分析细菌氧化亚铁能力：在细菌培养的过程中每隔一段时间测定一次溶液中亚铁离子的浓度；亚铁离子的浓度由重铬酸钾滴定法进行确定；

步骤五，金属离子浓度测定：金属离子的浓度由原子吸收分光光度法测定。

4.如权利要求3所述的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，其特征在于，步骤二中，细菌镜检具体包括：

将步骤一中得到的菌液，取100ml上清液，用无菌定性滤纸过滤，过滤后的滤液置于离心机中离心10min，转速为10000rpm，离心后可见底部白色沉淀物氧化亚铁杆菌，弃去上清液，将沉淀物用pH为1.8的无菌水清洗几次后，收集到无菌离心管中备用。

5.如权利要求4所述的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，其特征在于，收集到无菌离心管中的氧化亚铁杆菌样，进行冷冻干燥处理，然后电镜扫描；具体包括：

取10μl纯的氧化亚铁菌杆液，利用标准的革兰氏染色法，对细菌进行染色；染色完成后，将标本置于显微镜下，先用低倍镜找到目标后，滴一滴油在玻片上，用油镜继续分析细菌的颜色。

6.如权利要求3所述的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，其特征在于，步骤三中，绘制生长曲线具体包括：

进行细菌计数，所述细菌计数的方法包括：采用显微镜计数法；先用台盼蓝对菌液进行染色处理，死细胞被染成蓝色，活细胞不能被染成蓝色；然后用含有0.1％结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液进行染色，将细胞染成紫色；在显微镜下计数紫色细胞，通过计算得活菌数；

所述显微镜计数法结合显微镜和血球计数板来计数；先在血球计数板上盖上盖玻片，取20μl稀释后的菌液，滴于盖玻片侧边；在显微镜下观察血球计数板中间25个中方格内中间和四个角中方格的活细菌个数，取其平均值记为A，菌液稀释倍数记为B，则菌液中细菌浓度为4AB×106个/ml。

7.如权利要求3所述的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，其特征在于，步骤四中，分析细菌氧化亚铁能力具体包括：

在细菌培养的过程中每隔4h测定一次溶液中亚铁离子的浓度；

亚铁离子的浓度由重铬酸钾滴定法进行确定；具体滴定操作方法为：将摇瓶静置5min后，用移液枪取1ml上清液于50ml锥形瓶中，加入5ml硫磷混酸作为掩蔽剂，摇匀，30s后，加入3滴0.5％二苯胺磺酸钠作为指示剂，1min后，用0.010mol/L的重铬酸钾进行滴定；边滴定，边摇晃锥形瓶，至溶液由无色变为绿色最终变为浅紫色，若30s内颜色不再变化，则停止滴定；记录消耗重铬酸钾的体积；每份溶液重复滴定3次，取其平均值计算亚铁离子的浓度。

说明书

技术领域

本发明属于微生物浸矿领域，尤其涉及海洋菌浸出低品位硫化矿的方法。

背景技术

目前，国内外对于湿法冶金的研究都已经有很大进展，部分国家和地区已经将其提升到商业利用阶段，可利用湿法冶金进行大规模生产。

纵观微生物浸矿技术的发展史，不难发现，大致分可为三个阶段：

第一阶段：无意识阶段。

部分早期文明人例如罗马人，开始学会在矿山附近的水体或自矿山流出的水体中，回收利用铜。而其无意识体现在，这类早期文明人并没有意识到微生物在富集铜的过程中所起到的作用。

第二阶段：初步认识阶段。

20世纪四十年代至20世纪八十年代，人们开始意识到微生物的作用，并发现在浸出铜的过程中，细菌起到了氧化亚铁离子的作用，将Fe2+氧化为Fe3+，并把S氧化成SO42-，并能利用化学反应产生的能量进行自养。

第三阶段：快速发展阶段。

20世纪八十年代以后，微生物浸矿技术得到快速发展，并成为一个全新的研究领域，成为人们研究的热点。并在1980年，在智利，出现了世界上第一个将微生物浸矿应用到商业领域的矿山公司---铜堆浸。之后的十年间，全世界共14座铜堆浸厂建成运营。微生物浸出也相继成功用于提取金、铀、钴等矿物。近年来，微生物浸矿被广泛地应用到低品位硫化矿浸出和精矿处理领域。目前全世界已有近30个国家的科学工作者对微生物浸矿进行研究工作，并取得不错的进展，更加推动了浸矿技术的快速发展。

我国微生物浸矿技术的发展也大致分为三个阶段：

第一阶段：初步认识阶段

我国对于微生物浸矿的初步研究发生在20世纪五十年代。而真正有系统的研究，始于五十年代末期。五十年代末至六十年代初，我国的科学研究者通过研究不同矿山的主要菌种，分离出了不同的浸矿菌，包括氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌等多种菌种(嗜酸菌)，并初步研究了这类浸矿菌的菌落形态、微生物染色情况、生长所需营养物质、最适生长条件(温度、pH)等，为以后的更进一步的研究工作做了比较充分的准备。

第二阶段：深入研究阶段

20世纪六十年代到八十年代，我国的浸矿研究工作有了很大的突破，从第一阶段的研究细菌，发展为利用细菌进行浸矿实验。在这一阶段，一方面，科学工作者们在实验室进行的小型的浸出实验，旨在研究微生物浸出的内在机制。通过改变微生物浸矿时的生长环境，包括pH、温度、营养物质浓度等，使微生物的生长得到优化，更有利用矿物的浸出；另一方面，国内的具有前瞻性的矿业公司开始把微生物浸矿应用到工业生产中。典型代表是安徽铜陵有色金属公司松树山铜矿利用就地堆浸法浸出铜矿，成为我国第一个应用微生物大规模浸矿的公司。之后，我国相继出现了铀矿、高硫锰矿和锡矿的微生物工业应用。

第三阶段：广泛研究阶段

20世纪八十年代末期以后，微生物浸矿成为越来越多学者们研究的课题，也被越来越多的投入到工业化生产应用。原因是：一、矿产资源越来越少，容易开采的矿产资源更是日趋减少，传统的选矿方法得到的矿量在减少，相对成本在增加，环境污染治理费用也在增加，所以人们不得不采用微生物浸矿这一经济成本相对较低、环境成本也较低的冶金方法；二、微生物湿法冶金的不足之处在于，处理周期长，且对某些金属，微生物抗性不足，仍然需要大量的培养和筛选工作，成为人们深入并广泛研究的一个方向。

湿法冶金，从技术上分为金属浸出、净化和提取三类。主要步骤是：将原矿物破碎，置于溶液中，使其浸出。一段时间后，将矿渣与溶液分离，得到含有金属离子或化合物的溶液。将溶液净化和富集，一般采用萃取或化学沉淀等方法。之后，从富集的溶液中提取金属离子或化合物，一般采用电提取法；部分金属如钒、钨、钼在溶液中并不以离子形式存在，而是以含氧酸的形式存在，则先氧化，得到金属氧化物，再还原得到金属；还有些金属可直接采用氢还原。

浸出技术可细分为酸法浸出、碱法浸出和微生物浸出三类。其中酸法浸出和碱法浸出都属于物化浸出。酸浸是指：利用酸性溶液直接浸出矿石中的有用成分(金属或其化合物)。例如，硅酸盐型铀矿石，可直接用稀硫酸溶液浸出。碱浸是指：利用碱性溶液直接浸出矿石中的有用成分(金属或其化合物)。例如，碳酸盐型的铀矿石，可用碳酸氢钠和碳酸钠或碳酸氢铵和碳酸铵的混合溶液或碳酸氢铵溶液浸出。直接利用物理化学方法浸出，浸出速度快，浸出效果好，纯度高，但应用范围有限或者浸出条件苛刻，有时需高温、高压，危险性高，只能应用于特定种类的矿石，且成本太高。而微生物浸出则有更大的应用前景。本发明所分析的正是微生物浸出。

微生物浸出所涉及到的微生物种类繁多，复杂多样，至今没有也无法得到定论。已经研究的浸矿微生物多达20多种，可分为自养型微生物和异养型微生物两大类。

自养型微生物：缺乏EMP、ED途径以及TCA循环中关键的几种酶——六磷酸葡萄糖酸脱水酶等，因此不能通过自身将无机物合成有机物，而只能以空气中的CO2和微量的NH4+分别作为碳源、氮源，通过自身引发的化学反应，实现化能自养。浸出过程中主要有一下几种：

氧化亚铁硫杆菌：属于化能自养菌。简称T.f.，是酸性条件下微生物中的最主要浸矿菌种。中等嗜热性，不须外供有机物质。靠氧化二价铁、元素硫以及还原态的化合物等，来获取能量，吸收空气中的CO2，O2及其他无机物合成自身的细胞组织，进行自营生长繁殖。

氧化硫硫杆菌：同氧化亚铁硫杆菌一样，是典型的极端嗜酸性严格自养好氧的专性无机化能细菌，无机物氧化还原获得能量，但因为硫氧化还原过程的电位较高，因此该过程产生的能量只有很少部分能被细菌利用，从而这类细菌生长较为缓慢，不易快速获得后代。

氧化亚铁钩端螺旋菌：同氧化亚铁硫杆菌，属于无机化能自养菌。主要能量来源是氧化亚铁离子。

还包括硫化芽孢硫杆菌等其他比较少见的细菌。

这些细菌都适用于硫化矿物的浸出。

异养型微生物：通过有机物的氧化分解获得能量来源，以CO2作为碳源。主要包括真菌、霉菌和藻类等。

一般用于碳酸盐、硅酸盐等盐类矿物的浸出。或可用作金属浮选剂、絮凝剂、离子交换剂、离子吸附剂等金属离子或化合物的净化过程。

驯化育种：根据达尔文适者生存的理论，在不断变化的外界条件中，微生物会努力去适应环境，在适应的过程中，引发突变，从而出现一些最能适应某种特定的环境的异种微生物，并逐渐成为优势种。简言之，即改变环境，筛选优势种。应用于微生物浸矿中时，方法是使微生物在目标金属矿物存在的环境下，不断转代培养，并逐渐增加金属矿物的浓度。驯化研究表明氧化亚铁硫杆菌的抗锌能力是由染色体决定的。张卫民等进行了浸矿细菌驯化培养研究，驯化4次后，细菌氧化亚铁离子的速率明显加快。

诱变育种：利用物理化学手段诱发基因突变，物化手段包括：紫外线、亚硝基胍、微波等，在认为作用下，微生物细胞内的遗传物质在短时间内大量改变，出现多种异种菌，在众多不同的微生物中，筛选出最适应环境的优势种。例如蒋金龙等利用亚硝基胍对氧化亚铁硫杆菌进行诱变育种，发现诱变后菌种氧化亚铁的活性相比之前提高了4倍。但需注意，诱变完成后，要防止基因二次突变。

基因工程育种：通过基因改造或转基因的方法得到目的工程菌：

接合育种表明氧化亚铁硫杆菌可能存在自然接合作用，基因可在群中进行交流，同时表明对不同金属的抗性是由不同的基因片段的决定。

原生质体融合育种：优点是生理差异较大的菌种可以进行基因重组。但氧化亚铁硫杆菌等一些细菌属于革兰氏阴性菌，细胞壁过多的脂多糖阻碍了细胞原生质体的融合，难以通过原生质体融合法育种。

世界上大部分的金属，大约有90％，是通过电解冶金法和湿法冶金法从矿石中提取。这些方法通常会产生环境危害和健康风险，同时随着矿产资源的减少，容易开采的矿产资源更是愈发稀少，如何在有限的资源基础上更加充分的利用，成为人类世界的一大难题。因此人们一直在研究寻找其他可替代的危害较小又能充分利用资源的方法，其中就包括利用微生物从矿石或尾矿中提取人类社会必须的特殊金属。微生物是生物圈中必不可少的一份子，也是食物链中必不可少的一环，对于微生物的利用成为首要考虑也必须考虑的。

微生物的浸出过程中涉及到的典型的细菌包括中温及其他化学自养细菌，即氧化亚铁硫杆菌，氧化硫硫杆菌和钩端螺旋体杆菌等。而当今世界，全球气候变暖和二氧化碳排放的问题越来越收到人们的关注，因此微生物浸矿成为一种非常重要的矿物浸出方法，在增加金属产量的同时，又不会产生有害气体二氧化硫，是一种相对环保的技术手段。

总体来说，微生物浸矿相比以往的化学物理方法选矿，处理成本较低，处理效果更好，选矿纯度高，污染物质较少、易处理，能耗低，应用范围较广，因此，有非常大的研究价值，但也存在浸出周期长，浸矿效果不稳定的问题。目前，世界各地均进行着关于如何将低品味矿物投入到商业化大规模生产的研究，而由于每个实验所用到的矿石样品的不同，所使用的主要浸矿菌种也不相同，从而得到浸出效果也不尽相同。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前浸矿所使用的微生物大部分都是陆源微生物，海洋微生物生长的环境盐分比较高；浸出的效果具有一定的局限性，浸矿过程中，对盐分的抗性比较低，生物世界上大部分的金属，大约有90％，是通过电解冶金法和湿法冶金法从矿石中提取；这些方法通常会产生环境危害和健康风险，同时随着矿产资源的减少，容易开采的矿产资源更是愈发稀少，如何在有限的资源基础上更加充分的利用，成为人类世界的一大难题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种海洋菌浸出低品位硫化矿的方法。

本发明是这样实现的，一种海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，所述海洋菌浸出低品位硫化矿的方法利用一株在海陆交界处采集的一株氧化亚铁杆菌，通过连续培养后，在pH＝1.8，生长温度T＝30℃的情况下，连续浸矿28天后，浸出黄铜矿和闪锌矿。

进一步，所述海洋菌浸出低品位硫化矿的方法包括：

步骤一，培养细菌：调节基础培养基的pH，高压灭菌，趁热取FeSO4·7H2O溶解后，用滤膜将FeSO4溶液全部过滤；置于恒温摇床中，培养28h；然后置于恒温冰箱中，冷藏保存待用；

步骤二，细菌镜检：将步骤一中得到的菌液，取上清液，过滤后，离心，底部得到白色沉淀物氧化亚铁菌，弃去上清液，用无菌水清洗，收集到无菌离心管中备用；

步骤三，绘制生长曲线：进行细菌计数，采用显微镜计数法；

步骤四，分析细菌氧化亚铁能力：在细菌培养的过程中每隔一段时间测定一次溶液中亚铁离子的浓度；亚铁离子的浓度由重铬酸钾滴定法进行确定；

步骤五，金属离子浓度测定：金属离子的浓度由原子吸收分光光度法测定。

进一步，步骤一中，培养细菌具体包括：

调节9K基础培养基的pH为1.8，取100ml该培养基于锥形瓶中，于高压灭菌锅中121℃灭菌20min，趁热取15ml培养液将4.47gFeSO4·7H2O溶解后，加入1.0g/L矿样；用0.02mm滤膜将FeSO4溶液全部过滤到锥形瓶中；待锥形瓶内液体凉至室温，用移液枪取10ml氧化亚铁菌液于锥形瓶中；将锥形瓶置于30℃恒温摇床中，在160r转速下培养28h；然后置于4℃恒温冰箱中，冷藏保存待用；此时菌液中的细菌浓度为1×106cell/ml。

进一步，步骤二中，细菌镜检具体包括：

将步骤一中得到的菌液，取100ml上清液，用无菌定性滤纸过滤，过滤后的滤液置于离心机中离心10min，转速为10000rpm，离心后可见底部白色沉淀物Axm菌，弃去上清液，将沉淀物用pH为2.0的无菌水清洗几次后，收集到无菌离心管中备用。

进一步，收集到无菌离心管中的Axm菌样，进行冷冻干燥处理，然后电镜扫描；具体包括：

取10μl纯的Axm菌液，利用标准的革兰氏染色法，对细菌进行染色；染色完成后，将标本置于显微镜下，先用低倍镜找到目标后，滴一滴油在玻片上，用油镜继续观察细菌的颜色，并将相机摄像头对准镜头拍照。

进一步，步骤三中，绘制生长曲线具体包括：

进行细菌计数，所述细菌计数的方法包括：采用显微镜计数法；先用台盼蓝对菌液进行染色处理，死细胞被染成蓝色，活细胞不能被染成蓝色；然后用含有0.1％结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液进行染色，将细胞染成紫色；在显微镜下计数紫色细胞，通过计算得活菌数；

所述显微镜计数法结合显微镜和血球计数板来计数；先在血球计数板上盖上盖玻片，取20μl稀释后的菌液，滴于盖玻片侧边；在显微镜下观察血球计数板中间25个中方格内中间和四个角中方格的活细菌个数，取其平均值记为A，菌液稀释倍数记为B，则菌液中细菌浓度为4AB×106个/ml。

进一步，步骤四中，分析细菌氧化亚铁能力具体包括：

在细菌培养的过程中每隔4h测定一次溶液中亚铁离子的浓度；

亚铁离子的浓度由重铬酸钾滴定法进行确定；具体滴定操作方法为：将摇瓶静置5min后，用移液枪取1ml上清液于50ml锥形瓶中，加入5ml硫磷混酸作为掩蔽剂，摇匀，30s后，加入3滴0.5％二苯胺磺酸钠作为指示剂，1min后，用0.010mol/L的重铬酸钾进行滴定；边滴定，边摇晃锥形瓶，至溶液由无色变为绿色最终变为浅紫色，若30s内颜色不再变化，则停止滴定；记录消耗重铬酸钾的体积；每份溶液重复滴定3次，取其平均值计算亚铁离子的浓度。

本发明的优点及积极效果为：世界上大部分的金属，大约有90％，是通过电解冶金法和湿法冶金法从矿石中提取。这些方法通常会产生环境危害和健康风险，同时随着矿产资源的减少，容易开采的矿产资源更是愈发稀少，如何在有限的资源基础上更加充分的利用，成为人类世界的一大难题。因此人们一直在研究寻找其他可替代的危害较小又能充分利用资源的方法，其中就包括利用微生物从矿石或尾矿中提取人类社会必须的特殊金属。微生物是生物圈中必不可少的一份子，也是食物链中必不可少的一环，对于微生物的利用成为首要考虑也必须考虑的。

微生物的浸出过程中涉及到的典型的细菌包括中温及其他化学自养细菌，即氧化亚铁硫杆菌，氧化硫硫杆菌和钩端螺旋体杆菌等。而当今世界，全球气候变暖和二氧化碳排放的问题越来越收到人们的关注，因此微生物浸矿成为一种非常重要的矿物浸出方法，在增加金属产量的同时，又不会产生有害气体二氧化硫，是一种相对环保的技术手段。

总体来说，微生物浸矿相比以往的化学物理方法选矿，处理成本较低，处理效果更好，选矿纯度高，污染物质较少、易处理，能耗低，应用范围较广，因此，有非常大的研究价值，但也存在浸出周期长，浸矿效果不稳定的问题。目前，世界各地均进行着关于如何将低品味矿物投入到商业化大规模生产的研究，而由于每个实验所用到的矿石样品的不同，所使用的主要浸矿菌种也不相同，从而得到浸出效果也不尽相同。

本发明主要分析了利用一株海洋菌从矿石中浸出的铜、锌矿的微生物浸出过程，获得了更好的浸出效果。矿石样品来自于北京山长水远矿物标本公司。细菌Axm来源于厦门同安环湾地带工业废水排放的海陆交界区域。绘制了细菌的生长曲线，分析了细菌生长与氧化亚铁离子的关系，细菌浸出矿物实验是采用摇瓶实验进行分析。将矿石样品置于固定条件(160r·min-1)的旋转瓶中，分析培养基的初始pH值(1.7，1.8，1.9，2.0，2.1和2.2)、培养温度(28℃，30℃，32℃和34℃)对浸出效果的影响，以及最佳条件下的浸出率。微生物浸出效果通过计算浸出后介质中氧化亚铁的浓度和铜、锌的浓度与最初样品的浓度差来确定。结果表明,控制实验的条件可以使Axm菌浸出铜、锌矿效率更高，在9K培养基下，选择最优条件pH＝1.8，温度T＝30℃，培养基中浸出铜浓度约为207mg/L，浸出率60％；锌浓度约为523mg/L，浸出率78％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法流程图；

图2是本发明实施例提供的Axm菌的生长曲线的示意图；

图3是本发明实施例提供的Axm菌消耗亚铁离子的情况示意图；

图4是本发明实施例提供的pH对浸出锌矿时细菌生长的影响示意图；

图5是本发明实施例提供的温度对浸出锌矿时细菌生长的影响示意图；

图6是本发明实施例提供的细菌对锌含量的耐受性示意图；

图7是本发明实施例提供的细菌浸出闪锌矿的情况示意图；

图8是本发明实施例提供的有菌和无菌条件下闪锌矿的浸出情况示意图；

图9是本发明实施例提供的pH对浸出铜矿时细菌生长的影响示意图；

图10是本发明实施例提供的温度对浸出铜矿时细菌生长的影响示意图；

图11是本发明实施例提供的细菌对铜的耐受性示意图；

图12是本发明实施例提供的细菌浸出黄铜矿的情况示意图；

图13是本发明实施例提供的有菌和无菌条件下黄铜矿的浸出情况示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

目前，世界上大部分的金属，大约有90％，是通过电解冶金法和湿法冶金法从矿石中提取。这些方法通常会产生环境危害和健康风险，同时随着矿产资源的减少，容易开采的矿产资源更是愈发稀少，如何在有限的资源基础上更加充分的利用，成为人类世界的一大难题。

本发明将利用一株独特的海洋菌浸出特定矿物，来分析其最佳浸出条件和浸出效果。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明实施例提供的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法种海洋菌浸出低品位硫化矿的方法，利用一株在海陆交界处采集的一株氧化亚铁杆菌，通过连续培养后，在pH＝1.8，生长温度T＝30℃的情况下，连续浸矿28天后，浸出黄铜矿和闪锌矿。

如图1所示，本发明实施例提供的海洋菌浸出低品位硫化矿的方法包括：

S101：培养细菌：调节基础培养基的pH，高压灭菌，趁热取FeSO4·7H2O溶解后，用滤膜将FeSO4溶液全部过滤；置于恒温摇床中，培养30h；然后置于恒温冰箱中，冷藏保存待用；

S102：细菌镜检：将S101中得到的菌液，取上清液，过滤后，离心，底部得到白色沉淀物Axm菌(氧化亚铁杆菌)，弃去上清液，用无菌水清洗，收集到无菌离心管中备用；

S103：绘制生长曲线：进行细菌计数，采用显微镜计数法；

S104：分析细菌氧化亚铁能力：在细菌培养的过程中每隔一段时间测定一次溶液中亚铁离子的浓度；亚铁离子的浓度由重铬酸钾滴定法进行确定；

S105：金属离子浓度测定：金属离子的浓度由原子吸收分光光度法测定。

步骤一中，培养细菌具体包括：

调节9K基础培养基的pH为1.8，取100ml该培养基于锥形瓶中，于高压灭菌锅中121℃灭菌20min，趁热取15ml培养液将4.47gFeSO4·7H2O溶解后，用0.02mm滤膜将FeSO4溶液全部过滤到锥形瓶中。待锥形瓶内液体凉至室温，用移液枪取10mlAxm菌液于锥形瓶中；将锥形瓶置于30℃恒温摇床中，在160r转速下培养28h；然后置于4℃恒温冰箱中，冷藏保存待用；此时菌液中的细菌浓度大约为1×106cell/ml。

步骤二中，细菌镜检具体包括：

将步骤一中得到的菌液，取100ml上清液，用无菌定性滤纸过滤，过滤后的滤液置于离心机中离心10min，转速为10000rpm，离心后可见底部白色沉淀物Axm菌，弃去上清液，将沉淀物用pH为1.8的无菌水清洗几次后，收集到无菌离心管中备用。

收集到无菌离心管中的Axm菌样，进行冷冻干燥处理，然后电镜扫描；具体包括：

取10μl纯的Axm菌液，利用标准的革兰氏染色法，对细菌进行染色；染色完成后，将标本置于显微镜下，先用低倍镜找到目标后，滴一滴油在玻片上，用油镜继续观察细菌的颜色，并将相机摄像头对准镜头拍照。

步骤三中，绘制生长曲线具体包括：

进行细菌计数，所述细菌计数的方法包括：采用显微镜计数法；先用台盼蓝对菌液进行染色处理，死细胞被染成蓝色，活细胞不能被染成蓝色；然后用含有0.1％结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液进行染色，将细胞染成紫色；在显微镜下计数紫色细胞，通过计算得活菌数；

所述显微镜计数法结合显微镜和血球计数板来计数；先在血球计数板上盖上盖玻片，取20μl稀释后的菌液，滴于盖玻片侧边；在显微镜下观察血球计数板中间25个中方格内中间和四个角中方格的活细菌个数，取其平均值记为A，菌液稀释倍数记为B，则菌液中细菌浓度为4AB×106个/ml。

步骤四中，分析细菌氧化亚铁能力具体包括：

在细菌培养的过程中每隔4h测定一次溶液中亚铁离子的浓度；

亚铁离子的浓度由重铬酸钾滴定法进行确定；具体滴定操作方法为：将摇瓶静置5min后，用移液枪取1ml上清液于50ml锥形瓶中，加入5ml硫磷混酸作为掩蔽剂，摇匀，30s后，加入3滴0.5％二苯胺磺酸钠作为指示剂，1min后，用0.010mol/L的重铬酸钾进行滴定；边滴定，边摇晃锥形瓶，至溶液由无色变为绿色最终变为浅紫色，若30s内颜色不再变化，则停止滴定；记录消耗重铬酸钾的体积；每份溶液重复滴定3次，取其平均值计算亚铁离子的浓度

下面结合基本原理对本发明的作进一步描述。

本发明的基本原理是：

关于微生物浸矿的内在作用机制，人们普遍认为有两种机制，即直接和间接作用机制。

在直接机制作用下，细菌直接接触硫化矿表面，在外界水和空气的辅助作用下，将矿物氧化浸出。如下方程式：

其中M代表铜、锌、镍等各种金属元素。

在间接作用机制下，浸矿微生物并不直接将矿物质氧化，而是先通过自身大量的酶催化氧化矿物中的Fe(II)和S，得到Fe(III)和SO42-。这些酶包括铜蓝蛋白酶、Fe(II)的细胞色素、c-552氧化还原酶和c-552细胞色素[9]。之后，Fe(III)具有良好的氧化性能和浸出性能，作为化学浸出剂浸出矿物，得到反应产物Fe(II)，而Fe(II)被微生物氧化成为Fe(III)，如此循环，使得金属矿物不断被浸出。除去作用机制，许多影响因素，如矿物组成及操作条件，都会影响生物浸出效率和清洁萃取(微生物浸矿)的最终可行性。

而关于其中所发生物理化学反应的机理，大致可以用以下方程式来说明，以闪锌矿为例：

ZnS+2Fe3+→Zn2++2Fe2++S(0.3)

ZnS+0.5O2+H2SO4→ZnSO4+H2O+S(0.5)

因浸矿过程极为复杂，微生物种类、矿物质种类以及中间产物复杂多样，多数学者研究并证明了浸矿过程中的间接作用，而没有证据证明细菌的直接作用。K.J.Edwards等]利用电镜观察到硫化矿物表面的凹凸坑并没有微生物的痕迹，而是Fe3+腐蚀形成，因此得出，微生物对于矿物浸出没有直接作用，只有间接作用。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

1、实验材料

1.1实验菌株

本实验采用的菌种(氧化亚铁硫杆菌)取自厦门市同安区环湾地带海陆交界区域，属于海洋菌的一种。由于该区域作为工业废水处理后的出水口，长期含有一定浓度的金属离子或化合物，因此该区域的微生物对于环境中的金属离子可能有更好的耐受性。

本实验最终使用的纯菌种的来源是2015届毕业生程超同学提取和纯化实验的结果，命名为Axm。

1.2培养基

浓缩盐溶液，即9K培养基，就是用来培养细菌的培养液。它是由3g/L(NH4)2SO4，0.1g/LKCl，0.5g/LK2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.01g/LCa(NO3)2组成。

在没有添加铁的情况下，介质被称为0K培养基。培养基要通过0.22μm过滤膜过滤，或经高压灭菌，得到杀灭其他细菌的目的。

1.3矿石样品

本次试验中用到的铜矿和锌矿是纯矿物，来自北京山长水远矿物标本公司，大部分是铜、锌，将矿样分别经过200目的筛子，得到粒径<0.15mm的矿石颗粒。样品处理方法是：将矿样置于热空气干燥炉中，在105℃下干燥3h。之后，再将每种矿石样品取15g置于高压灭菌锅内(LDZX-50KBS，山东),在103kPa,121℃条件下灭菌20min，以防止其他微生物的污染。

1.4主要实验仪器

实验用的主要仪器如表1-1所示：

表1-1主要试验仪器

1.5实验药品

实验用的主要化学药剂如表1-2：

表1-2主要实验药剂

2实验方法

2.1细菌的培养

调节9K基础培养基的pH为2.0，取100ml该培养基于锥形瓶中，于高压灭菌锅中121℃灭菌20min，趁热取15ml培养液将4.47gFeSO4·7H2O溶解后，用0.02mm滤膜将FeSO4溶液全部过滤到锥形瓶中。待锥形瓶内液体凉至室温，用移液枪取10mlAxm菌液于锥形瓶中。将锥形瓶置于30℃恒温摇床中，在160r转速下培养30h。然后置于4℃恒温冰箱中，冷藏保存待用。此时菌液中的细菌浓度大约为1×106cell/ml。

2.2细菌镜检

将步骤2.1中得到的菌液，取100ml上清液，用无菌定性滤纸过滤，过滤后的滤液置于离心机中离心10min，转速为10000rpm，离心后可见底部白色沉淀物，即为Axm菌，弃去上清液，将沉淀物用pH为2.0的无菌水清洗几次后，收集到无菌离心管中备用。

先取上述步骤中收集的菌样，进行冷冻干燥处理，然后电镜扫描。

取10μl纯的Axm菌液，利用标准的革兰氏染色法，对细菌进行染色。染色完成后，将标本置于显微镜下，先用低倍镜找到目标后，滴一滴油在玻片上，用油镜继续观察细菌的颜色，并将相机摄像头对准镜头拍照。

2.3绘制生长曲线

细菌计数方法：本实验采用显微镜计数法。先用台盼蓝对菌液进行染色处理，死细胞被染成蓝色，活细胞不能被染成蓝色。然后用含有0.1％结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液进行染色，将细胞染成紫色。在显微镜下计数紫色细胞，即可通过计算得活菌数。显微镜计数法是结合利用显微镜和血球计数板来计数。先在血球计数板上盖上盖玻片，取20μl稀释后的菌液，滴于盖玻片侧边。在显微镜下观察血球计数板中间25个中方格内中间和四个角中方格的活细菌个数，取其平均值记为A，菌液稀释倍数记为B，则菌液中细菌浓度为4AB×106个/ml。

2.4考察细菌氧化亚铁能力

操作方法同2.1。在细菌培养的过程中每隔4h测定一次溶液中亚铁离子的浓度。

亚铁离子的浓度由重铬酸钾滴定法进行确定。具体滴定操作方法为：将摇瓶静置5min后，用移液枪取1ml上清液于50ml锥形瓶中，加入5ml硫磷混酸作为掩蔽剂，摇匀，30s后，加入3滴0.5％二苯胺磺酸钠作为指示剂，1min后，用0.010mol/L的重铬酸钾进行滴定。边滴定，边摇晃锥形瓶，至溶液由无色变为绿色最终变为浅紫色，若30s内颜色不再变化，则停止滴定。记录消耗重铬酸钾的体积。每份溶液重复滴定3次，取其平均值计算亚铁离子的浓度。

2.5金属离子浓度测定

金属离子的浓度由原子吸收分光光度法测定。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：微生物浸出实验方法

微生物浸出实验是在250ml锥形瓶中进行。在使用之前，锥形瓶需要在高压灭菌锅中，103kPa,121℃条件下，持续灭菌20分钟。之后，每个瓶中加入10mL氧化亚铁硫杆菌液和100ml 9K培养基，进行细菌培养。细菌接种量约为1×106cell/ml。为了创造细菌呼吸的良好环境(氧气和二氧化碳气体正常交换)，将锥形瓶置于有孔隙的恒温震荡培养箱中培养，培养条件为250r·min–1，温度可调节。

(1)pH对浸出效果的影响

由分析可知，Axm菌的最佳生长pH值为2.0。本发明也进行了验证，证实Axm菌最佳生长温度确为2.0。但由于矿样中所含有的物质复杂多样，可能含有酸性或碱性物质而改变溶液的酸碱度，因此细菌生长的最佳pH值不一定是细菌浸矿的最佳pH值。

在进行实验之前，先调节培养基的pH分别为1.7、1.8、1.9、2.0、2.1，分别取100ml与锥形瓶中，各加入4.47gFeSO4.7H2O，待其溶解后，加入1.0g/L矿样，再加入10ml混匀的菌液。置于温度T＝30℃，转速N＝160r/min的摇床中进行培养。每隔8h取1ml溶液对亚铁离子进行滴定。记录数据。

(2)温度对浸出效果的影响

Axm菌的最佳生长温度值为30℃。证实Axm菌最佳生长温度确为30℃。但通过查阅文献，细菌的最佳生长温度，并不一定是细菌浸矿的最佳温度。

在进行实验之前，调节培养基的pH＝1.8，取100ml调好pH的培养基分别置于4个锥形瓶中，各加入4.47gFeSO4.7H2O，待其溶解后，加入1.0g/L矿样，再加入10ml混匀的菌液。将4个锥形瓶分别置于转速N＝160r/min，温度T分别为28℃，30℃，32℃，34℃的摇床中进行培养。每隔8h取1ml溶液对亚铁离子进行滴定。记录数据。

(3)细菌对金属离子的耐受性

对Zn2+的耐受性：在进行实验之前，调节培养基的pH＝1.8，摇瓶中先加入100ml调好pH的培养基及4.47gFeSO4.7H2O，待其溶解后，再分别加入1.0g/L，2.0g/L，3.0g/L，4.0g/L，5.0g/L，7.0g/L，9.0g/L的Zn2+，再加入10ml混匀的菌液，盖好透气盖，将摇瓶置于30℃，160r/min的摇床中培养。每隔8h取1ml溶液对亚铁离子进行滴定。记录数据。

对Cu2+的耐受性：在进行实验之前，调节培养基的pH＝1.8，摇瓶中先加入100ml调好pH的培养基及4.47gFeSO4.7H2O，待其溶解后，再分别加入1.0g/L，2.0g/L，3.0g/L，4.0g/L，5.0g/L，7.0g/L，9.0g/L的Cu2+，再加入10ml混匀的菌液，盖好透气盖，将摇瓶置于30℃，160r/min的摇床中培养。每隔8h取1ml溶液对亚铁离子进行滴定。记录数据。

(4)浸出率的分析

在Axm菌的最佳浸矿条件下，连续浸矿28天。每隔四天，将培养基静置5min后，取少量上清液，稀释一定倍数，用原子吸收分光光度法测定金属离子浓度。根据初始浓度和测得的浓度之差，计算浸出率。同时，在不加入细菌而其他条件相同的情况下，做对比实验。

实施例2：细菌镜检

Axm菌形状为杆状，表面凹凸不平且有细纹,Axm菌经革兰氏染色后呈现紫色，说明其为革兰氏阴性菌。

实施例3：细菌生长曲线的绘制

由图2可知，Axm菌的生长同大多数微生物一样，大致经历了四个时期，停滞期，对数生长期，稳定期，衰亡期。Axm菌的停滞期比较短，在8h时进入对数生长期。在20h-32h之间时，是稳定期。32h之后，进入衰亡期。结合下图3可知，32h后进入衰亡期，是因为培养基内的亚铁离子全部被氧化了。

实施例4：细菌氧化亚铁能力

由图3可知，Axm菌氧化亚铁的平均速率为0.24g/L·h。经查阅文献可知，大多数矿物浸出中涉及到的中温菌氧化亚铁的速率低于0.20g/L·h[16]。证明了取自厦门同安海域的Axm菌有更强的氧化亚铁能力。

观察曲线的变化情况，在0h-12h内，亚铁离子的消耗速率较慢，约0.09g/L·h。在16h后，亚铁离子消耗速率明显加快，约为0.38g/L·h。由此得出结论，Axm菌氧化亚铁的速率与细菌的生长关系密切。在16h-32h内，细菌数量最多，因此氧化亚铁离子的速率也最快。基本随着菌液中细菌浓度的增加，氧化亚铁的速率也随之增加。因此，可用亚铁离子的消耗情况来反应细菌的生长情况。

实施例5：细菌浸出闪锌矿的研究

(1)pH对细菌浸出锌矿的影响

由图4可知，pH对浸矿时细菌消耗亚铁的影响并不是线性变化的，也就是说浸矿时细菌的生长，并不是pH越高越好，或者越低越好。在温度T＝30℃，锌矿的添加量为1.0g/L的情况下，pH值为1.7至2.2之间时，细菌生长状态都受到抑制，但程度不同。在pH＝1.7和pH＝2.2时，细菌生长受到更大程度的抑制。在pH＝1.8或pH＝1.9时，亚铁离子消耗速率快于其他情况，细菌生长状况较好。其中pH＝1.8时，是细菌浸出锌矿的最佳条件。

(2)温度对细菌浸出锌矿的影响

由图5可知，温度对浸矿时细菌消耗亚铁的影响并不是线性变化的，也就是说浸矿时细菌的生长并不是温度越高越好，或者越低越好。在pH＝1.8，锌离子的添加量为1.0g/L的情况下，在28℃至34℃情况下，生长状态都比较好，未受到明显的抑制。其中T＝30℃时，亚铁离子消耗速率最快，生长状况最好。因此温度T＝30℃是细菌浸出闪锌矿的最佳条件。

(3)细菌对锌含量的耐受性

由图6可知，加入锌之后，即使在本实验设置的最低含量1.0g/L的情况下，细菌的生长仍然受到了非常明显的抑制。而在5.0g/L及以上的矿样浓度下，细菌的生长被严重阻碍或抑制了，消耗亚铁离子的速率极为缓慢。在浓度为4.0g/L时，细菌勉强能够生长。在1.0g/L到4.0g/L之间，细菌生长受到不同程度的抑制，随锌浓度增大，抑制程度越大，但均能相对较好的生长。因此得出结论，细菌对于锌的耐受性为4.0g/L。

(4)细菌浸出锌矿的情况

由图7可看出，细菌对于锌的浸出，随浸出时间的增长，锌浸出率越大。但并不是呈线性变化的。这可能是因为细菌的生长不仅受到培养基中亚铁离子浓度的影响，还受到环境中不利于细菌生长的其他金属离子的影响。因此在前期，因为溶液中有较多的亚铁离子，细菌生长较快，浸出锌的速率也较快。而中期亚铁离子浓度降低，细菌要适应菌液中越来越多的锌离子和越来越少的亚铁离子，浸出锌的速率有所降低。而后期，由于细菌适应了这种环境，浸出锌速率又有所提升。由此可见，Axm菌有望通过驯化培养，达到更好的浸出锌效果。

(5)细菌对锌矿的浸出能力

由图8可以看出，在没有加入细菌而其他条件与有菌时相同的条件下，溶液中也有少量的锌浸出，培养相同天数28天后，锌的浸出率为17％。而在加入Axm菌的情况下，细菌的浸出率为78％，远远超过无菌情况。因此，利用细菌来浸出矿物将会大大提高浸出效率。

实施例5细菌浸出黄铜矿的分析

3.1pH对细菌浸出铜矿的影响

由图9可知，pH对浸矿时细菌消耗亚铁的影响并不是线性变化的，也就是说浸矿时细菌的生长，并不是pH越高越好，或者越低越好。在温度T＝30℃。铜矿的添加量为1.0g/L的情况下，pH值为1.7至2.2时，细菌生长状态都较好，未受到明显干扰。但pH＝1.7时，细菌生长最差。在pH＝1.8或pH＝2.0时，亚铁离子消耗速率快于其他情况。其中pH＝1.8时，是细菌浸出黄铜矿的最佳条件。

3.2温度对细菌浸出铜矿的影响

由图10可知，温度对浸矿时细菌消耗亚铁的影响并不是线性变化的，也就是说浸矿时细菌的生长，并不是温度越高越好，或者越低越好。在pH＝1.8，铜矿的添加量为1.0g/L的情况下，在28℃和34℃情况下，生长状态不怎么好。而温度在30℃-32℃的范围内亚铁离子消耗速率较快，生长较为正常。其中T＝30℃时，是细菌浸出黄铜矿的最佳条件。

3.3细菌对铜含量的耐受性

由图11可知，细菌对铜的耐受性并不好。细菌对铜的耐受性比锌更差。即使在本实验设置的最低含量1.0g/L的情况下，细菌的生长已受到非常明显的影响。而在3.0g/L及以上的矿样浓度下，细菌的生长已经被严重阻碍或抑制了。在浓度为1.0g/L到2.0g/L时，细菌生长受到不同程度的抑制，随锌离子浓度的增大，抑制程度越大，但细菌均有明显生长趋势。因此得出结论，细菌对于铜的耐受性为2.0g/L。

3.4细菌浸出铜矿的情况

由图12可看出，细菌对于铜的浸出，随浸出时间的增长，铜浸出率越大。但并不是呈线性变化的。这可能是因为细菌的生长不仅受到培养基中亚铁离子浓度的影响，还受到副产物黄钾铁钒沉淀的影响。由于在在浸矿过程中，在矿物表面生成黄钾铁钒沉淀，从而阻碍了细菌与矿物表面和Fe3+的充分接触，随着浸矿时间的增加，矿物表面的细菌浓度越来越低，对生物浸出体系产生了钝化作用。因此在前期，因为溶液中有较多的亚铁离子，较少的黄钾铁钒沉淀，细菌与矿物的接触较好，浸出铜的速率快。而后期亚铁离子浓度降低，黄钾铁钒沉淀生成量增加，细菌浸出铜的速率明显降低。由此可见，控制黄钾铁钒的生成，是提高浸矿效率的一个重要研究方向。同时，Hugues等，在78℃条件下利用嗜热嗜酸菌浸出黄铜矿精矿，搅拌浸出5d后，浸出率高达90％，却浸渣中检测出大量黄钾铁钒。因此，采用嗜热菌搅拌浸出能控制黄钾铁钒在矿物表面的钝化作用。

3.5细菌对铜矿的浸出能力

由图13可以看出，在加入Axm菌的情况下，培养28天后，细菌的浸出率为60％。可见细菌对黄铜矿中铜的浸出效果并不是很好。如3.4.4所说，这可能是因为在浸矿过程中副产物黄钾铁钒沉淀的生成，阻碍了细菌与矿物表面以及Fe3+的充分持续接触，从而导致最终浸矿效果不理想。但同时，黄钾铁钒的生成与浸矿体系的环境条件也有一定的关系。黄钾铁钒沉淀生成的量随着pH的增大而增大，因此要适当控制较低的pH。由2.4.1的结论可知，本实验Axm菌浸出黄铜矿的最佳pH条件为1.8。在没有加入细菌而其他条件与有菌时相同的条件下，溶液中也有少量的铜浸出，铜的浸出率为10％。远远低于有菌情况。因此，相比无菌，利用细菌来浸出矿物将大大提高浸出效率。

结论：

本发明主要分析了Axm菌浸出黄铜矿和闪锌矿的最佳条件，及最佳条件下的浸出效果。主要结论如下：

(1)Axm菌的生长需要从氧化亚铁离子的过程中获得能量，亚铁离子的消耗情况可反映出细菌的生长情况。

(2)Axm菌在最佳初始生长pH＝1.8，最佳生长温度T＝30℃的情况下，浸出闪锌矿的效果最好。最佳条件下培养28天后，锌离子的浸出率为78％。锌的浸出速率先较快后稍微下降最终又加速，体现了细菌对于环境的适应过程，因此Axm菌有望通过驯化培养，达到更好的浸出闪锌矿的效果。

(3)Axm菌在最佳初始生长pH＝1.8，最佳生长温度T＝30℃的情况下，浸出黄铜矿的效果最好。最佳条件下培养28天后，铜离子的浸出率为60％。铜的浸出速率先比较快，后逐渐变得缓慢，是由于副产物黄铁钾钒的钝化作用，因此减小钝化作用的影响是提高浸出铜效率的重要分析方向。

(4)Axm菌对铜离子最大耐受浓度为2g/L。Axm菌对锌离子最大耐受浓度为4g/L。

5)有菌情况下，闪锌矿和黄铜矿的浸出率远远高于无菌情况。因此利用特定细菌在特定条件下进行矿物浸出将大大提高浸矿效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。